嵌合抗原受体基因修饰T细胞治疗胶质母细胞瘤的研究进展

刘磊，董星辰，梁家政，宋旭东，丁涟沭

(南京医科大学附属淮安第一医院神经外科，江苏 淮安 223001)

胶质瘤是最常见的原发性脑恶性肿瘤，由几种表型和分子类型不同的肿瘤组成，根据世界卫生组织制订的分级系统，脑胶质瘤分为1级(恶性程度最低、预后最好)到4级(恶性程度最高、预后最差)[1]。美国每年新诊断原发性脑肿瘤约5万例，其中约50%患者脑肿瘤的组织病理学分类为胶质瘤，其中多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)最具侵袭性。GBM自发且发展迅速，几乎没有已知的危险因素，与家族遗传关系不大(<1%)，患者5年生存率低于5%[2]。目前GBM的治疗包括手术切除、化疗、放疗、抗血管生成药物和交变电场、免疫治疗等综合治疗，但患者预后较差。

胶质瘤由独特的遗传和表观遗传变化导致的关键生物通路上调或沉默引发，上述变化的下游效应通过调节复杂的信号通路和蛋白质之间的相互作用，调节肿瘤细胞的发生、增殖、侵袭和凋亡。癌症基因组图谱提供了低级别胶质瘤和GBM基因组特征的详细视图，胶质瘤中广泛的基因突变和信号异常是肿瘤生长、侵袭以及血管生成和抗凋亡的内在驱动因素[3]。根据基因表达对GBM诊断和分类标准进行重新定义，有助于针对分子靶点GBM进行精准治疗。在众多的免疫疗法中，嵌合抗原受体基因修饰T细胞(chimeric antigen receptor gene modified T cell，CAR-T细胞)治疗被认为是最具潜力和前景的治疗方式之一。目前，CAR-T细胞治疗是肿瘤学中最有效的治疗选择之一，临床采用其治疗CD19阳性白血病和淋巴瘤的效果较好[4]。美国食品药品管理局已经批准CAR-T细胞治疗用于血液系统肿瘤的治疗[5]。现就CAR-T细胞治疗GBM的研究进展予以综述。

1 CAR-T细胞概述

1.1CAR-T细胞结构 CAR-T细胞是一种基因修饰的T细胞，其表面表达的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)可识别和降解肿瘤细胞。CAR由细胞外抗原识别结构域(又称胞外区)、跨膜结构域(又称铰链区)和细胞内T细胞信号结构域三个部分组成[6]。胞外区由单链可变区组成，单链可变区来源于抗体的轻链和重链，该结构域有助于以非人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)依赖的方式识别肿瘤特异性抗原。铰链区是连接细胞外区和跨膜区的连接域，来源于IgG4或CD8分子，细胞内结构域由CD3ζ组成，可触发和激活免疫反应。

1.2CAR-T细胞迭代历程 在第一代CAR-T细胞中，仅CD3ζ可作为胞内结构域，只能提供T细胞活化信号，其难以在体内增殖，且抗瘤活性较低。在第二代和第三代CAR-T细胞内的信号转导结构域中加入CD137、CD28、OX40等共刺激分子，第二代由一个共刺激结构域组成，第三代CAR-T细胞则能够搭载多个共刺激分子结构域，使CAR-T细胞的增殖活性和细胞因子释放量明显增加，有效延长了其在体内的生存时间，具有更强的细胞毒活性。第四代CAR-T细胞有白细胞介素(interleukin，IL)-12和IL-15等额外的基因编码的抗肿瘤细胞因子[7]，并在CAR-T细胞原有基因编码的基础上增加了调控功能，形成自杀启动型、负性调节型、开关启动型CAR-T细胞，从而更好地控制CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤反应。目前，第四代CAR-T细胞已经广泛用于临床研究，其功能作用主要依赖于细胞内的信号转导结构域。

1.3CAR-T细胞制作过程 CAR-T细胞治疗是一种基于自体细胞的治疗方法，利用白细胞分离术分离外周血T细胞，通过慢病毒载体转导技术将CAR构建体转染到活化的T细胞中，然后转基因T细胞通过体外细胞培养系统进行扩增，在不同系统产生不同比例的效应型、幼稚型或记忆型T细胞。可见，通过改变条件、控制表型即可产生特定的T细胞子集[8]。

1.4CAR-T细胞治疗的作用机制 CAR-T细胞治疗是一种定制的肿瘤免疫疗法，将体外修改的免疫成分重新注入患者体内是CAR-T治疗的基础。CAR-T细胞识别肿瘤特异性抗原并与其结合，可活化初级T细胞，并导致细胞因子释放、溶细胞性脱颗粒和T细胞增殖[9]。附加的T细胞效应机制和记忆反应以依赖于共刺激机制的方式发生。因此，CAR-T细胞能够诱导确定的肿瘤相关抗原为靶点的持久的抗肿瘤效应[10]。一般情况下，CD8+T细胞是引起肿瘤细胞溶解和降解的细胞毒细胞，而CD4+T细胞起辅助作用，可增强CD8+T细胞的细胞毒性[11]。CAR-T细胞可激活Fas/Fas配体死亡受体途径并分泌破坏肿瘤细胞的穿孔素酶，从而诱导细胞毒作用。

1.5CAR-T细胞抗原靶点 用于CAR-T细胞治疗的抗原靶点包括IL-13受体α2、人表皮生长因子受体2、表皮生长因子受体变异体Ⅲ(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ，EGFRvⅢ)，上述靶点在GBM呈特异性表达，且其过表达多提示患者预后不良。Wu等[12]发现，针对IL-13受体α2、人表皮生长因子受体2、EGFRvⅢ的CAR-T细胞在儿童GBM的临床治疗中表现出良好的疗效，且不良事件发生率较低。此外，其他潜在靶点(人酪氨酸蛋白激酶受体A2、双唾液酸神经节苷脂、分化抗原簇70等)在GBM中的应用尚有待进一步临床试验的验证。

2 GBM治疗现状

GBM是最常见的原发性脑恶性肿瘤，侵袭性极强、预后极差。目前GBM的治疗方案包括手术切除、局部和全身化疗、放疗、抗血管生成药物和交变电场等，但GBM患者预后较差，中位总生存期为12～15个月。GBM主要以手术切除治疗，即使术中完成切除肿瘤，术后仍会复发，且化疗的作用也十分有限。GBM是一种高度变异和异质性的肿瘤，对化疗不敏感，且对正常、健康组织有不良影响。此外，血脑屏障阻止了绝大多数肿瘤治疗药物进入脑实质[13-14]，这是影响化疗成功的另一个主要原因。

肿瘤微环境的免疫抑制特性会抑制细胞毒性T细胞的增殖，限制肿瘤细胞裂解[15]。术后存在肿瘤残留的GBM患者，即使接受辅助化疗和放疗，预后也较差。除放疗外，目前GBM治疗还可选择烷基化和抗血管生成药物(如替莫唑胺、贝伐单抗)，但其临床益处和生存率改善作用有限。基于免疫治疗的迅速发展，尤其是T细胞代表了抗肿瘤反应的关键成分，因其具有异质性和突变负荷的特点，故可作为高度特异的肿瘤细胞抗原，因此，CAR-T细胞免疫治疗是治疗复发性GBM的一种新选择。CAR-T细胞治疗是一种将基因工程、非HLA依赖、抗原特异性受体插入T细胞的过继细胞转移疗法，其可以启动肿瘤特异性和持续性的抗肿瘤免疫反应。

3 GBM的CAR-T细胞治疗

3.1GBM免疫治疗特点 肿瘤细胞利用免疫系统进行增殖和转移。常见的肿瘤免疫逃逸机制包括抗原性丧失、免疫原性丧失(抗原处理或呈递缺陷)、免疫抑制特性[如分泌抑制性细胞因子IL-10、细胞内源性转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)]、癌基因和抑癌基因的遗传改变以及免疫检查点[细胞毒性T淋巴细胞抗原-4和程序性细胞死亡受体1(programmed cell death receptor 1，PD-1)]的过表达。

中枢神经系统因缺乏功能性的淋巴系统而被认为有免疫豁免特权，不能通过外周免疫进行监测。研究发现，硬脑膜中存在淋巴管网络[16]。淋巴管通常将间质液体从组织中排出，使其降解并进入循环系统。在感染或癌症期间，淋巴运输通过向引流淋巴结提供抗原和抗原前体细胞建立适应性免疫反应。大脑通过淋巴回流将脑脊液(携带细胞外蛋白、抗原和溶质)和间质液体进行广泛交换，使间质液体被收集并排入颈部淋巴结[17]，故认为大脑受外周免疫系统调控，即中枢神经系统并没有获得免疫特权[18]。

3.2CAR-T细胞治疗

3.2.1CAR-T细胞治疗的特点 CAR-T细胞治疗提供了一种新的方法来绕过缺陷的免疫系统，对抗与GBM相关的血脑屏障和肿瘤微环境所造成的各种障碍。T细胞工程技术可构建一种自体细胞产物，该产物的单链可变片段的靶向亲和力高，能够增强T淋巴细胞识别抗原与活化的能力，继而发挥抗肿瘤作用[19-20]。CAR-T细胞治疗主要通过结合颗粒酶/穿孔素裂解途径与单链抗体的特异性介导强大的抗肿瘤效应。

3.2.2CAR-T细胞治疗的优势 传统的T细胞受体的激活过程复杂，需要经过抗原处理和抗原呈递多个步骤，以激活主要组织相容性复合体依赖的T细胞，且T细胞反应仅限于多肽抗原。但CAR-T细胞是一种基因工程受体，可不依赖于主要组织相容性复合体[20]来诱导抗原的高度特异靶向性。在胶质瘤中，主要组织相容性复合体通常下调[21]，因此CAR-T细胞的优越性显得尤为突出。此外，CAR-T细胞不依赖于HLA和抗原呈递，也能对非肽类抗原产生免疫应答[22]。因此，CAR-T细胞中存在HLA非依赖的、肿瘤特异性的T细胞活化和增殖，并可导致肿瘤细胞的溶解和降解。此外，表达CD28信号域的CAR-T细胞可以促进IL-2的产生，并维持T细胞的增殖，且CAR-T细胞还可以抵抗由TGF-β和调节性T细胞介导的免疫抑制。

与常规GBM治疗相比，CAR-T细胞治疗具有不可替代的绝对优势。首先，GBM常表现出抗原呈递和主要组织相容性复合体呈递缺陷[23]，且不表达激活幼稚T细胞所需的共刺激分子，导致肿瘤特异性T细胞缺失。然而，CAR-T细胞治疗不需要抗原呈递，且CAR结构包括共刺激结构域，故无初级免疫反应过程。其次，CAR-T细胞可直接定位于胶质瘤干细胞。胶质瘤干细胞是一组具有独特分子特征的细胞，可形成肿瘤生态位，在胶质瘤的发生和发展中起关键作用[24]。体外研究证实，CAR-T细胞治疗具有对抗胶质瘤干细胞的有效性[25]。此外，胶质瘤干细胞表达的人表皮生长因子受体2、EGFRvⅢ和IL-13受体α2是目前针对GBM中CAR-T细胞的肿瘤相关抗原靶标的主要研究对象[26]。因此，CAR-T细胞治疗可能有助于清除具有自我更新能力且利于肿瘤增殖的细胞，而这些细胞常导致抗肿瘤治疗耐药性的产生。最后，CAR-T细胞治疗避免了HLA分子下调带来的影响。HLA分子下调是肿瘤免疫逃逸的典型机制，而CAR-T细胞不需要与HLA分子相互作用。

3.3CAR-T细胞治疗GBM的临床前研究及应用 CAR-T细胞需克服胶质瘤免疫微环境中各种因素的抑制作用，才能实现对肿瘤细胞的靶向识别和杀伤，其中任何步骤受阻均可能严重影响CAR-T细胞治疗的效果和安全性。CAR-T细胞成功进入胶质瘤后会遇到两个主要障碍：①免疫抑制细胞和胶质瘤免疫微环境中的抑制分子对CAR-T细胞的抑制和损害作用；②肿瘤抗原识别的干扰，主要由胶质瘤异质性和特异抗原不足导致，两者均是导致CAR-T细胞功能失效的重要原因。临床前研究提示，单靶点的CAR-T细胞治疗的临床效果欠佳，但多靶点的CAR-T细胞以及改善免疫微环境的复合型CAR-T细胞治疗的效果较好[27]。非单靶标CAR结构(双靶CAR和多靶CAR等)被广泛研究，近年研究发现，非单靶标CAR结构可提高CAR-T细胞与肿瘤细胞的结合效率，避免抗原逃逸[28]。

近年来，CAR-T细胞治疗用于胶质瘤治疗的研究逐渐增多，特别是对于敲除PD-1的EGFRvⅢ-CAR-T细胞治疗GBM的研究。大多数GBM表现出EGFR的频繁扩增，提高了GBM的增殖、侵袭能力和治疗耐药性，且EGFRvⅢ作为EGFR改变的子集，约占GBM标本的30%[29]。由于EGFRvⅢ在GBM细胞中表达，其突变是理想的CAR-T治疗靶点[30-31]。程序性细胞死亡因子配体1表达于多种肿瘤细胞，包括GBM细胞[32-35]。肿瘤相关的程序性细胞死亡因子配体1与细胞毒性T淋巴细胞上的PD-1结合，可促进细胞毒性T淋巴细胞凋亡，从而抑制抗肿瘤免疫反应。抑制PD-1的表达可促进抗原特异性CAR-T细胞的存活，因此PD-1阻断治疗CAR-T细胞可能为GBM的治疗提供新思路[36]。Zhu等[37]发现，PD-1基因敲除增强了EGFRvⅢ-CAR-T细胞对程序性细胞死亡因子配体1的EGFRvⅢ GBM细胞的裂解活性。

Hegde等[38]设计了一种CAR，它与人表皮生长因子受体2结合单链可变区以及IL-13受体α2结合IL-13突变体相连接形成的串联CAR-T细胞能够增强小鼠GBM模型T细胞功能，并减少抗原逃逸。细胞内源性TGF-β是多种实体肿瘤中的免疫抑制因子。Chang等[39]的研究发现，在胶质瘤治疗中，CAR-T细胞靶向多种可溶性配体(包括TGF-β等)的疗效显著，故TGF-β可作为T细胞的有效靶点。

常规CAR-T细胞治疗实体瘤面临多重挑战，其中包括肿瘤微环境的免疫抑制。Tang等[40]采用CRISPR/CAS9技术完全阻断TGF-β信号后，不仅有效阻止了CAR-T细胞的耗竭，还提高了CAR-T细胞的增殖。敲除TGF-β基因可极大地改善CAR-T细胞在富含TGF-β的肿瘤环境中的体内外功能，为提高CAR-T细胞治疗胶质瘤的效果提供了一种新方法。综上所述，通过多靶点CAR-T细胞或构建复合型CAR-T细胞治疗胶质瘤均获得了一定的临床疗效。

4 小 结

目前，CAR-T细胞治疗GBM的临床应用效果尚不明确，仍存在很多问题，如CAR-T细胞肿瘤浸润的增强、输液剂量和频率的优化、免疫抑制肿瘤微环境的调节以及胶质瘤异质性和特异抗原的不足等。由于GBM异质性以及缺乏相对特异性肿瘤抗原治疗靶点，目前需要寻找特异性更强的靶抗原和优化的CAR结构，以提高CAR-T细胞对抗免疫抑制微环境的能力。此外，由于单一CAR分子修饰T细胞并不能有效地清除脑肿瘤细胞，因此必须引入二次基因改造，以产生更有效的CAR-T细胞，但额外修饰常引发各种安全性和毒性问题。综上，使用安全开关(如自杀基因)诱导或控制CAR系统可能会解决CAR-T细胞诱导的毒性问题。随着研究的不断深入，未来CAR-T细胞将安全有效地用于GBM的临床治疗。