不同中药调控Wnt/GSK-3β/β-连环素蛋白通路治疗骨质疏松症的研究现状

卫成军 张智海 郑琦 许灿 张振南 白杨 于潼 李玉彬

中国中医科学院广安门医院骨科，北京 100053

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是随着年龄增长，由各种原因导致的以骨量逐渐开始减少，骨组织的微细结构变细变小为特征，容易产生脆性骨折、严重影响健康的一种常见病。近年来围绕其发生、发展及调控机制的研究越来越多。骨组织的代谢过程由不断进行的骨形成和骨吸收共同维持，当破骨细胞造成的骨吸收比成骨细胞支持的骨形成明显时，骨小梁含量降低，骨的脆性增加，导致骨质疏松。骨重建过程受到许多转录因子和细胞因子的调控，包括Wnt/β-catenin信号通路、TGF/BMP信号通路、Hedgehog通路等，其中最为经典的为Wnt/β-catenin信号通路。有研究表明当Wnt/β-catenin信号通路激活后，可诱导人体内成骨细胞的分化，提高成骨细胞的活性和矿化能力，最终使骨量增加，骨的机械应力增强。因此围绕此通路的基因表达，便成为一些中药治疗骨质疏松的依据，也成为寻找高效的临床治疗药物的突破点。

1 中医药治疗骨质疏松症的中医理论基础

临床医生越来越重视利用中医中药治疗骨质疏松症。传统中医文献并无“骨质疏松”记载，但传统医学中的“骨痿”的临床症状及其病因病机分析，与骨质疏松症最为相似、关系最为密切。中医理论中常见“肾为先天之本”的表述。如《素问·六节藏象论》云“肾者，主蛰，封藏之本，精之处也，其华在发，其充在骨，为阴中之少阴，通于冬气。”明确指出肾主藏精，有生髓壮骨之功能[1]。《医经精义》云：“骨者，肾之所合；髓者，肾精所生，精足则髓足；髓在骨内，髓足则骨强。”故“肾精亏虚”是骨质疏松症的发病关键[2-3]。《灵枢·经络篇》提出：“足少阴气绝，则骨枯……”用中医理论解释，肾精气不足，骨髓生成乏力，不能营养骨骼，最终导致“骨痿”。现代研究也提示“肾主骨生髓”，肾阳虚或者肾阴虚的患者临床检测骨密度，常常发现骨质疏松症[4-5]。董万涛等[6]认为，髓虚骨枯为其主要病机。故临床一线常常以上述中医思想及理论指导中药使用，对骨质疏松症进行相关治疗。

2 Wnt/β-catenin通路治疗骨质疏松症的作用机制

Wnt 信号通路是一种作用广泛的经典信号通路，在骨骼生长发育及骨髓干细胞转化等多种过程起重要作用。该通路主要通过β-连环素蛋白(β-catenin)介导，进入到细胞核内，对基因进行一定调控来影响成骨细胞的功能。有研究发现Wnt/GSK-3β/β-catenin信号通路作用于骨的生长发育各个阶段，激活Wnt/GSK-3β/β-catenin信号通路能促进骨髓中出现更多的成骨细胞增殖和分化，从而促进骨形成，增加骨密度[7-8]。Kim等[9]认为激活Wnt/GSK-3β/β-catenin信号通路诱导骨髓干细胞的同时，也能增加碱性磷酸酶的数量，促使成骨细胞分化趋势增加，减少向脂肪细胞和软骨细胞的分化趋势；同时增加分泌胞外基质，骨细胞的矿化得到增强。

β-catenin进入细胞质中，其中一部分进入细胞核内，与转录因子作用后，便可促进成骨细胞的分化，并且抑制向破骨细胞的分化(图1)；多项基础研究显示Wnt/β-catenin信号通路主要涉及一系列蛋白表达，例如最常见的β-catenin、跨膜受体(frizzled、LRP5/6)、TCF/LEF及细胞外因子(Wnt)等[10]。无细胞外因子Wnt时，得到支架蛋白(axin)辅助，β-catenin与GSK-3β、APC基因表达产物形成某种复合体，并且开始一些磷酸化表现。而在有细胞外因子Wnt时，Wnt就会与两种膜受体LRP5/6受体和frizzled结合，此时会抑制GSK-3β活性，β-catenin磷酸化过程和降解途径被切断，结果细胞质内β-catenin堆积，当堆积到一定量时，β-catenin进入细胞核调节靶基因的表达[9,11]。这个过程就解释了β-catenin信号表达程度能够影响骨的代谢[12-14]。经典的Wnt/β-catenin信号通路被激活后，可以抑制β-catenin降解，使β-catenin稳定并聚集于细胞核内，经过转录调控，促进成骨细胞分化，且抑制了破骨细胞分化[15]。当然，Wnt 信号还可以通过兴奋 Runx2 来诱导成骨，属于另外一条通路，其中Wnt10b 的过度表达以后，能够抑制骨丢失并通过上调 Runx2驱动间充质干细胞分化[16]，由此可见，随着围绕该经典通路基础研究范围的逐步扩大，也许会发现几个“切入点”，通过对骨骼成骨与破骨之间的代谢调控进行人工干预，从而为骨质疏松症的治疗提供更多思路。

图1 Wnt/GSK-3β/β-连环素蛋白信号通路作用机制示意图Fig.1 Schematic diagram of the mechanism of action of Wnt/GSK-3β/β-catenin signaling pathway

3 中医药通过调控Wnt/β-catenin通路治疗骨质疏松的研究进展

如何提高成骨细胞活性，促进成骨分化，绕不开激活Wnt/GSK-3β/β-catenin信号这条经典通路，研究表明一些中药及相关成分能够调控该通路，进而促进骨质疏松症的有效治疗。文献报道[17-18]调控Wnt/GSK-3β/β-catenin通路的中药有经典方剂右归丸、左归丸和金匮肾气丸等，药物及药物成分有独活、龟板、白藜芦醇、淫羊藿苷、芝麻素、小檗碱、姜黄素、黄芩苷等，本文归纳总结了通过该通路起作用的单味中药或有效成分及中药复方，以及相关药物在该领域的研究进展。

多项研究[19-23]表明白藜芦醇、蛇床子素、淫羊藿苷及黄酮类化合物在细胞水平或在动物实验研究水平能够对成骨有明显促进作用。

单味中药独活为毛当归的干燥根，有特异香气，味苦、辛、微麻。归肾、膀胱经。《神农本草经》记载：独活主风寒所击，金创止痛……久服，轻身耐老。说明早在在东汉时期医家就观察到独活的“抗衰老”作用。《中国药典》收录：独活具有祛风除湿，通痹止痛的作用，主要用于风寒湿痹、腰膝疼痛等。现代药理学研究显示独活可解痉止痛，抗血栓，提高免疫力。临床上常用以独活为主要药物的“独活寄生汤”治疗骨质疏松症患者，取得了良好的效果。姚琦等[24]利用高剂量独活治疗骨质疏松症模型大鼠，发现其骨组织的GSK-3β、β-catenin表达量变化明显，能够增强成骨细胞骨形成，抑制破骨细胞，从而增加骨密度。

龟板具有益肾强骨的作用。余翔等[25]探讨了补肾中药龟板促进 BMSCs增殖和成骨分化的作用及let-7f 对TNFR2的靶向调控作用。分别以Western blot、qPCR 检测TNFR2、β-cantenin、GSK3β的mRNA 表达，观察到龟板可促进BMSCs增殖、成骨分化和矿化，let-7f-5p可靶向TNFR2调控Wnt/β-catenin通路，抗激素性骨质疏松症。

白藜芦醇是一种二苯乙烯类的植物雌激素，中药藜芦、虎杖以及食物花生和葡萄中均含有该成分[26]。刘兆平等[27]、Boyden等[28]研究已证实白黎芦醇具有雌激素样作用，还具有抗氧化、调节血脂、抗肿瘤和抗血小板聚集等生物活性作用。对去卵巢骨质疏松大鼠经含白藜芦醇药液灌胃3个月后，检测到GSK3β mRNA的表达显著降低，β-catenin mRNA的表达显著增加，表明该药物可能通过促进GSK-3β磷酸化，以及胞内β-catenin的集聚以致部分转入到胞核中起作用，因此，认为白藜芦醇促进成骨的作用可能与Wnt/β-catenin信号通路有关[29]。

姜黄素是一种姜黄属植物(Curcumin longa L)根茎提取物，已被证实可以对抗激素诱导的大鼠骨质疏松。陈之光[30]运用荧光定量PCR技术，发现这种药物可以干预到大鼠模型组骨组织和原代培养成骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键蛋Wnt、β-catenin、LRP5等mRNA 表达情况，检测到较多的成骨细胞分化和成熟相关蛋白如Runx2、Osterix、Osteocalcin的mRNA表达情况，因此发现该药物是利用兴奋成骨细胞中的 Wnt/β-catenin信号通路，诱导骨保护素(osteoprotegerin，OPG)的表达而抑制破骨细胞分化[31]。

在一些药物成分常规研究中发现，如小檗碱、淫羊藿苷、黄芪甲苷、黄芪苷和骨碎补总黄酮等天然药物均具促进成骨细胞分化达到抗骨质疏松的作用[32]，并且该作用是通过经典Wnt/β-catenin 传导通路来调整控制并最终实现的[33]。例如，Tao等[34]发现小檗碱可通过对氧化应激效应的抑制，降低炎症因子和骨形成蛋白的生成，产生细胞外因子Wnt，从而刺激β-catenin向核内移动，抑制骨髓间充质干细胞向破骨分化，诱导其成骨分化，从而来改善大鼠骨的形态，提高骨密度，为临床应用小檗碱来防治骨质疏松提供理论依据。陈广明等[35]在用淫羊藿水提取液干预去卵巢骨质疏松大鼠后，从 Western-blotting 得到了部分验证其能够升高 Runx2 mRNA表达，升高β-catenin，说明该药物同样可激活此信号通路，进而影响骨保护素水平，从而达到控制成骨和破骨的平衡。

黄芪具有补气固表，利尿托毒，排脓之功，用于气虚乏力、表虚自汗、水肿痈疽等症，现代药理研究表明黄芪有强心、降压、抑菌、抗疲劳作用。黄芪甲苷是从黄芪中提取的有效成分。成鹏等[36]通过对大鼠的绝经后骨质疏松模型灌药观察，发现黄芪甲苷能够提高大鼠模型的骨密度，增强其生物力学强度，证明黄芪甲苷能够有效抑制绝经后大鼠骨质疏松的进展。在实验中同时检测到Wnt2 蛋白和β-catenin表达都明显升高，说明黄芪甲苷对骨质疏松的抑制有可能是通过Wnt2/β-catenin通路实现的。

中药黄芩清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎，临床用于治疗湿温、暑温、黄疸泻痢等，现代药理学认为，从黄芩中提取出的黄酮类化合物黄芩苷，具有抗炎、抑菌、解痉、镇静等作用。近来多项研究表明黄芩苷能够提升碱性磷酸酶活性，提高β-catenin、Wnt10a的蛋白表达水平，促进骨髓干细胞向成骨细胞分化，因此黄芩苷对成骨细胞分化的影响并不是通过雌激素信号通路来实现的，而是激活了Wnt/β-catenin通道的信号蛋白完成的[37-38]。

中药麻油味甘性凉，有润肠通便，解毒生机的作用，用于治疗肠燥便秘，皮肤皴裂等症。天然芝麻素存在于芝麻油中，可从芝麻油中提取出来，也可人工合成。马忠平等[39]对从大鼠分离出的骨髓间充质干细胞经芝麻素干预后，通过Western blotting检测 Wnt/β-catenin通路表达情况，了解到β-catenin和LRP5 的表达明显升高，而GSK-3b下降，并与芝麻素的浓度呈正相关。因此芝麻素能够激活Wnt/β-catenin通路，诱导骨髓间充质干细胞的成骨细胞分化，阻断骨质疏松的进展，可用于防治骨质疏松。

至于传统经典名方治疗骨质疏松症的成方主要有右归丸、左归丸和金匮肾气丸等，其中，右归丸温补肾阳，填精益髓，可用于治疗肾阳不足的腰膝酸软、肢节痹痛，方中运用菟丝子、鹿角胶、杜仲增强附子、肉桂的补肾阳之力，由熟地黄、山药、山茱萸配合当归、枸杞养血滋阴，充分体现了中医“善补阳者必阴中求阳”的思想，现代医学因其“填精益髓”，用来治疗骨质疏松症。章建华等[40]对右归丸的研究发现，右归丸能够提升ALP、ERK1、ERK2 mRNA及β-连环素蛋白(β-catenin)蛋白的表达，促进成骨分化，可用来治疗骨质疏松。显然，这个过程是通过Wnt/β-catenin、ERK1/2信号通路来实现的。在这个研究中同时发现右归丸对辩证为肾阳虚的骨质疏松作用更强，符合中医辨证施治的原则。

左归丸滋阴补肾，填精益髓，用于治疗肾阴不足的腰膝酸软等症，运用龟板、枸杞子配合熟地黄、山药、山茱萸滋阴补肾，牛膝、菟丝子强筋壮骨，鹿角胶温补肾阳，奏“阳中求阴”的辩证思想。因历代医家用于治疗腰膝酸软，则在防治骨质疏松得以重视。多项研究[41-44]表明左归丸能够激活Wnt/β-catenin信号通路，GSK-3β活性降低，抑制了其对β-catenin磷酸化，β-catenin被降解减少，向细胞质内移动聚集，部分进入细胞核内部，诱导骨髓干细胞的成骨分化。研究还发现运用左归丸后碱性磷酸酶活性明显提高，证明了左归丸的促进成骨作用。动物实验中的组织样本HE染色证实，左归丸中、高剂量组和雌二醇组股骨骨细胞数量增加，骨小梁增粗，排列渐规整清晰。同时发现左归丸对辩证为肾阴虚骨质疏松的诱导成骨基因表达作用更强。

金匮肾气丸温补肾阳，用于肾阳不足所致腰膝酸软，畏寒疼痛等症，方中重用六味地黄丸(地黄、山萸肉、山药、茯苓、牡丹皮、泽泻)辅助附子、桂枝阴阳并补，以求“阳得阴助生化无穷”，作为补肾的经典方剂，对历代医家运用补肾方剂具有深远影响，宋朝以后就认为肾气丸为阴阳双补，能够抗衰老、美颜、益寿。现代药理研究表明肾气丸具有改善微循环、抗衰老、增强免疫等作用，并且能影响蛋白、糖及脂肪代谢。金匮肾气丸在临床应用中，发现其改善消渴病症状的同时还可起到治疗骨质疏松症的功效。本药中重用的“地黄”，其活性成分梓醇同样起到如左归丸类似的作用。相关文献研究[45]提示金匮肾气丸治疗女性绝经后骨质疏松症6个月，与治疗前相比可以明显降低骨硬化蛋白表达，提高骨密度。金匮肾气丸治疗基于消渴病引发的骨质疏松症各种作用机制中，推测其可能通过激活Wnt/GSK-3β/β-catenin信号通路，调控自噬，抑制细胞内氧化应激水平，达到治疗糖尿病性骨质疏松症，此机制需要进一步深入研究。

4 小结

上述研究表明，多种中药成分都能够通过激活Wnt/GSK-3β/β-catenin信号通路，抑制GSK-3β的表达，促使细胞胞质中有更多的β-catenin向核内转移，进而诱导骨髓干细胞向成骨细胞分化，以达到增加骨密度的目的。这些中药及其有效成分的积极作用，比目前临床中经常使用的化学药物如降钙素、阿仑膦酸钠、唑来磷酸钠(抑制破骨细胞活性)等更胜一筹，也比甲状旁腺激素(特立帕肽)等不良反应更小。这些中药有效成分所起作用的机制类似治疗艾滋病毒的“鸡尾酒”药物组，可以认为中药在中医理论的指导下同样合成了天然的“鸡尾酒”药物组来治疗骨质疏松症。因此，开展中医药防治骨质疏松症的科学研究具有更高的研究价值。