基于UPLC指纹图谱及化学模式识别分析的四季三黄片质量一致性评价△

雷蓉，周亚楠，白洁，苏建，刘永利

河北省药品医疗器械检验研究院 河北省中药质量评价与标准研究重点实验室，河北 石家庄 050227

药品质量的一致性是临床有效性和安全性的重要保证。中成药组方药味多，成分复杂，如何进行一致性评价一直是中药质量评价的关键问题，原辅料质量、药品生产工艺参数和人员变动等因素都会影响到批间的一致性[1-2]。色谱指纹图谱能较为全面地展现组方中各药味的化学组成，在中药质量的整体评价中作为一种较为成熟的技术得到广泛应用。化学模式识别技术主要包括主成分分析（PCA）、聚类分析（HCA）、偏最小二乘法-判别分析（PLSDA）等，通过降维对指纹图谱数据综合分析，达到分类、识别并筛选质量差异标志物的目的。目前，色谱指纹图谱结合化学模式识别已成为一种重要的中药质量评价方式[3-21]。

四季三黄片收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》第二十册，由大黄、黄芩、黄柏、栀子4 味中药制成，具有消炎退热、通便利水的功效，临床上主要用于治疗口鼻生疮、咽喉肿痛、大便秘结、小便赤黄等症[22]。本研究采用超高效液相色谱法（UPLC）建立了四季三黄片的指纹图谱，指认了21 个共有峰，在指纹图谱相似度评价的基础上，结合化学模式识别技术分析评价了23 批来源于4 个不同生产企业的样品质量与批间一致性，为四季三黄片整体质量评价提供参考。

1 材料

1.1 仪器

超高压液相-离子阱静电场轨道阱质谱联用仪（UPLC LTQ Orbitrap MS，配备Dionex UltiMate 3000 型UPLC 仪、LTQ-Orbitrap Elite 组合型高分辨质谱仪，美国Thermo 公司）；XPE26 型电子天平（0.001 mg）、XS105DU 型电子天平（0.01 mg）均购于瑞士Mettler-Toledo 公司；KQ-500DE 型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；Milli-Q 型超纯水系统（美国Millipore公司）。

1.2 试药

对照品栀子苷（批号：110749-201919，纯度：97.1%）、黄芩苷（批号：110715-201821，纯度：95.4%）、盐酸小檗碱（批号：110713-201212，纯度：86.8%）、黄芩素（批号：111595-201808，纯度：97.9%）、汉黄芩素（批号：111514-201706，纯度：100.0%）、芦荟大黄素（批号：110795-201710，纯度：99.5%）、大黄酸（批号：110757-201607，纯度：99.3%）、大黄素（批号：110756-201512， 度：98.7%）、汉黄芩苷（批号：112002-201702，纯度：98.5%）、大黄酚（批号：110796-201922，纯度：99.4%）、大黄素甲醚（批号：110758-201817，纯度：99.2%）均购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均为色谱纯；三氟乙酸（色谱纯，天津化学有限公司）；水为超纯水。23批四季三黄片抽自全国各地经营、使用单位，涉及4 家生产企业，其中A 企业样品4 批次（S1～S4）、B企业样品2批（S5～S6）、C企业样品6批（S7～S12）、D企业样品11批（S13～S23）。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Shimadzu Shim-pack gist C18（100 mm×2.1mm，2 μm），以乙腈（A）-0.1%三氟乙酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～10 min，10%～15%A；10～20 min，15%～30%A；20～30 min，30%～42%A；30～45 min，42%～75%A）；体积流量为0.3 mL·min-1；柱温为30 ℃；进样量为2 μL；检测波长为254nm。UPLC LTQ Orbitrap MS分析过程以0.1%甲酸水溶液为流动相B，其余条件同上。

2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）喷雾电压:+3.5 kV；鞘气流速：35 arb；辅助气流速：10 arb；毛细管温度：300 ℃；加热器温度：300 ℃；扫描方式：傅里叶变换高分辨全扫模式，数据依赖性DDA-MS2，扫描范围：m/z150～2000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液制备 取盐酸小檗碱、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为0.08055、0.20330、0.05013、0.08887、0.03105、0.014 20、0.019 97、0.009 18、0.017 90、0.016 94、0.025 91 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取四季三黄片粉末0.4 g，精密称定，放置到锥形瓶中，精密加70%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声（700 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取供试品溶液（S9），按2.1.1 项下色谱条件进样6 次，测定并分析数据，以4 号峰（黄芩苷）为参照峰，各共有色谱峰相对保留时间的RSD为0.02%～0.19%，相对峰面积的RSD为0.17%～1.66%，表明仪器的精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同一批次的样品（S9），按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，平行6 份，按2.1.1 项下色谱条件测定并分析，以4 号峰（黄芩苷）为参照峰，各共有色谱峰的相对保留时间的RSD 为0.01%～0.11%，相对峰 面积的RSD 为0.41%～1.96%，表明方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取编号S9 供试品溶液，分别在0、1、3、6、12、16、24 h 进样测定并分析，以4 号峰（黄芩苷）为参照峰，各共有色谱峰的相对保留时间的RSD 为0.03%～0.23%，相对峰面积的RSD 为0.30%～2.18%，表明供试品溶液在制备后24 h内稳定性良好。

2.4 指纹图谱的建立及相似度评价

2.4.1 指纹图谱的建立和共有峰的指认 取23批四季三黄片的供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件检测，记录色谱图。采用“中药指纹图谱相似度评价系统”（2012版）对23批样品的色谱图进行分析，将S1样品的色谱图设为参照图谱，时间窗宽度为0.1 min，多点校正后自动峰匹配，标定了21 个共有峰，所有样品的叠加图见图1，典型样品和对照品色谱图见图2，其中11个峰采用对照品比对进行了确证，其余的10个共有峰采用LTQ Orbitrap 高分辨质谱技术进行指认，离子碎片信息见表1。共有峰中1 号峰来自于栀子，2、9、18 号峰来自黄柏，3～7、10～14 号峰均来自黄芩，15、16、19～21号峰来自大黄。

表1 四季三黄片正离子模式下的化合物鉴定及归属

图1 23批四季三黄片的UPLC叠加图

图2 四季三黄片混合对照品和样品的UPLC图

2.4.2 相似度评价 对23批四季三黄片的指纹图谱进行相似度分析，结果见表2。A 企业的样品相似度均在0.979以上，B企业样品相似度为0.869～0.944，C 企业样品相似度为0.442～0.973，D 企业样品相似度为0.730～0.933，表明4 家生产企业样品质量差异较大，A、B、D 3家企业内不同批次样品质量一致性较好，而C企业不同批次样品质量一致性较差。

2.5 化学模式识别

2.5.1 HCA HCA 可以更直观地展现样品批间化学组分的差异性，利用OriginPro 2021软件对21个共有峰的相对峰面积数据进行系统HCA，结果见图3。23批样品按各生产企业聚为3类，A、D 企业各为一类，B、C企业聚为一类，

图3 23批四季三黄片的HCA

2.5.2 PCA 采用SIMCA 12.0 软件23 批样品的21 个共有峰数据进行PCA，以主成分特征值及累积方差贡献率进行筛选，通过绘制的得分图与载荷图对模型进行解释，进一步应用Hotelling'sT2和DModX控制图对样品批间质量进行监测。

模型拟合后共提取5 个主成分，累积方差贡献率为93.7%，见表3。其中PC1和PC2累积方差贡献率为70.4%，可以代表21 个共有峰的主要信息，绘制得分图（图4）、载荷图（图5）。由图4 可知，23批样品按不同企业分类明显，与HCA 结果一致，表明不同企业间样品一致性较差。载荷图距离原点越远的变量，权重越大，代表该化合物的含量对样品的整体分布所起的作用越大。由图5可知，C21（大黄素甲醚）、C2对PC1贡献较大，C4、C6（黄芩苷）对PC2贡献较大。

图4 23批四季三黄片样品的PCA散点得分

图5 23批四季三黄片样品的主成分载荷图

表2 23批样品的指纹图谱相似度评价分析结果

表3 四季三黄片PCA特征值与累积方差贡献率 %

2.5.3 Hotelling'sT2和DModX 控制限的建立 Hotelling'sT2和DModX控制图用来监测不同批次的产品的一致性，是2 个互补的多变量分析手段，可用于分析超出控制限批次产品的异常波动受哪些变量的影响[20]。Hotelling'sT2和DModX 的控制图见图6～7，图中T2Crit（99%）和D Crit 为控制限，其上限分别为25.95、1.59；图中的T2Crit（95%）为警戒限，上限为17.06。23 批样品的波动范围在均在控制限之下，为正常批次产品。

图6 23批四季三黄片样品的Hotelling's T2控制图

2.5.4 PLS-DA 经过上述分析，虽然各批次产质量均在可控范围内，未出现异常批次，但各企业间样品分类明显，为进一步筛选出导致23 批样品产生差异的成分，采用OPLS-DA，利用变量重要性投影（VIP）值进行预测分析（图8）。以VIP 值＞1 为标准，筛选出C18、C5、C10、C2、C19、C4、C6、C9、C7、C1、C21 11个化合物为引起样品间差异的主要因素。其中影响较大的是C18、C5 和C10，其中C18 来源于黄柏，C5 和C10 来源于黄芩，提示生产企业应关注黄柏、黄芩投料的原药质量。

图7 23批四季三黄片样品的DModX控制图

图8 四季三黄片的OPLS-DA的VIP值（, n=23）

3 讨论

3.1 色谱条件优化

在供试品溶液制备方法考察时，分别考察了不同提取方式（超声、回流）、不同提取溶剂（50%甲醇、70%甲醇、甲醇）、不同提取时间（15、30、45 min）、不同提取溶剂体积（25、50、100 mL）对四季三黄片中有效成分提取的影响，综合色谱峰数量及响应值，确定采用70%甲醇超声提取30 min 的方法。

在考察液相色谱条件时，分别考察了以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%三氟乙酸和乙腈-0.1%醋酸铵为流动相梯度洗脱，结果表明，乙腈-0.1%三氟乙酸梯度洗脱呈现的色谱峰分离度良好，峰形最佳。并通过全波长扫描，样品在254 nm 下色谱峰较多，且峰面积较大，故选择了254 nm 作为检测波长。

3.2 不同企业间样品质量一致性分析

由相似度、PCA、HCA 结果可知，不同企业间样品质量差异明显，尤其C 企业与其他3 家差距大，通过进一步对筛选出来的3 个影响较大的差异标志性化合物C18、C5 和C10 原始数据分析，发现C 企业样品中这3个化合物的相对含量均远低于其他3个企业，表明C 企业所投黄柏、黄芩质量与其他3 家有较大差异，提示企业应关注这2种中药的质量。

3.3 同一企业不同批次样品质量一致性分析

由以上结果可知，A、B、D 3家企业内样品质量一致性较好，而C企业内样品批次间一致性较差，将其指纹图谱数据进行PCA，模型拟合后共提取2个主成分，累积方差贡献率为82.1%，将6 批样品明显沿PC1分成了两类，其中S8、S12为一类，其余4批为一类，对分布贡献较大的化合物为C4、C1、C2，其中C4 来源于黄柏，C1 来源于栀子，C2 来源于黄芩，S8、S12中3个化合物的相对含量均明显低于其他批次，提示C 企业黄柏和黄芩原料的质量不稳定，建议重点关注。

建立以质量一致性为核心的中成药质量评价体系有利于促进中成药质量的全面提升。本研究所建立的四季三黄片UPLC 指纹图谱结合模式识别分析的方法可对四季三黄片的质量一致性进行评价，可为全面提升该产品质量提供参考。