基于UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技术的苗族药刺梨叶化学成分分析△

徐浩然，乔溪莹，2a，张童画，于庚原，毕玥琳，冯欣，韦坤益，孙毅坤*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；

2.北京中医药大学 附属护国寺中医医院，北京 100035

刺梨叶又称缫丝花叶，是蔷薇科植物缫丝花Rosa roxburghiiTratt.及单瓣缫丝花R.roxburghiiTratt.f.normalisRehd.et Wils.的干燥叶，主产地为贵州，为贵州苗族等少数民族用药。刺梨叶味甘、酸涩，归脾、肾、胃经，具有消食化积的功效，主治食积、疥痛、破伤风等症，是小儿消食开胃颗粒和消痞和胃胶囊的组成药味之一[1-2]。现代研究表明，刺梨叶中含有黄酮、氨基酸、有机酸、多酚、三萜、植物甾醇和维生素C 等多种化学物质[3-4]。但是，有关刺梨叶化学成分全面分析鉴定的研究鲜有报道。因此，本研究采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱法（UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS）对刺梨叶中的化学成分进行定性鉴定研究，为刺梨叶后续药理作用研究和质量标准建立提供参考。

1 材料

1.1 仪器

CPA225D 型电子天平（德国Sartorius 公司）；HH-S4A 型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；Milli-Q Advantage A10 型超纯水仪（北京五洲东方科技有限公司）；U3000型超高效液相色谱、QExactive 型质谱仪[美国Thermo Fisher Scientific 公司，配有电喷雾离子源（ESI）及Xcalibur 3.0 数据处理系统]。

1.2 试药

刺梨叶（批号：20190302，贵州永乐药业有限公司）经北京中医药大学中药学院孙毅坤教授鉴定为蔷薇科植物缫丝花Rosa roxburghiiTratt.及单瓣缫丝花R.roxburghiiTratt.f.normalisRehd.et Wils.的干燥叶，阴干，粉碎，备用；水为超纯水；甲醇、乙腈和甲酸为质谱级（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

精密称取刺梨叶粉末3.00 g 置于100 mL 具塞锥形瓶中，按照料液比1∶10 精密加入75%甲醇30.0 mL，摇匀，水浴加热回流2 h，取出静置放冷，上清液经0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液做进一步分析。

2.2 色谱条件

色谱柱为Waters UPLC C18（150 mm×2.1 mm，1.7 µm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～2 min，5%B；2～17 min，5%～98%B；17～20 min，98%B；20～23 min，98%～5%B；23～25 min，5%B）；流速为0.3 mL·min-1；柱温为40 ℃；进样量为2 μL。

2.3 质谱条件

离子源为ESI；在正、负离子模式下进行扫描，扫描方式为全扫描/数据依赖二级扫描（Full scan/ddMS2），扫描范围为m/z100～1200；毛细管温度为350 ℃；负离子模式下喷雾电压为3800 V，正离子模式下喷雾电压为3200 V；鞘气流速为35 arb；辅助气流速为15 arb；MS2采用低、中、高3 种碰撞能，正离子模式下碰撞能分别为30、40、50 eV，负离子模式下碰撞能分别为30、50、70 eV；一级质谱分辨率为Full Scan 70 000 FWHM（Full Width at Half Maximum），二级质谱分辨率为MS/MS 17 500 FWHM。

2.4 化学成分检测与分析

取2.1 项下供试品溶液5 μL，按照2.2 项下色谱条件及2.3 项下质谱条件进样分析，采用检测得到刺梨叶化学成分的m/z和保留时间（tR）等质谱信息。使用Xcalibur 3.0软件进行质谱数据处理，通过高分辨率质谱信息推导其可能的分子式，质谱偏差（δ）≤5×10-6。分析正、负离子模式下一级质谱准分子离子峰及二级质谱特征碎片离子，结合相关文献及化合物裂解规律共鉴定化学成分。

3 结果与分析

3.1 刺梨叶化学成分分析

根据正、负离子模式下一级质谱的准分子离子峰及二级质谱特征碎片离子，结合文献及化合物裂解规律共鉴定出刺梨叶中57 个化学成分。ESI+和ESI-模式下刺梨叶的基峰离子流（BPI）色谱图见图1～2，鉴定结果见表1。

表1 刺梨叶中化学成分鉴定

续表1

续表1

图1 ESI+模式下刺梨叶的BPI图

图2 ESI-模式下刺梨叶的BPI图

3.2 裂解规律推导

3.2.1 黄酮类成分分析 从刺梨叶中共鉴定出21个黄酮类化合物。黄酮类化合物泛指2 个苯环通过中央3 个碳原子互相连接而成的具有C6-C3-C6基本骨架的化合物在其A 环和B 环上常连接甲基或者甲氧基等官能团，并且常与糖结合成苷。黄酮类化合物的主要裂解方式以糖苷键断裂，狄尔斯-阿尔德（RDA）反应裂解，CO2、CO等中性离子丢失为主。

化合物11的tR为1.16 min，可观察到准分子离子峰m/z289.070 7 [M-H]-，推断其分子式为C15H14O6；二级质谱图中母离子失去1 分子H2O 得到m/z271.061 6离子，失去1分子CO2得到m/z245.082 1离子，在C 环发生RDA 裂解生成m/z137.023 5 的离子碎片，结合负离子模式下的准分子离子及特征碎片离子信息，比对相关文献可确定该化合物为黄酮类化合物儿茶素[2,8-9]，其二级质谱图见图3，特征裂解规律见图4。

图3 儿茶素的二级质谱图

图4 儿茶素的质谱裂解规律

化合物25的tR为5.34 min，可观察到准分子离子峰m/z577.135 7[M-H]-，即原花青素B2的C 环经RDA 裂解失去C8H8O3后再失去1 分子H2O 得到二级碎片m/z407.077 9[M-H-C8H8O3-H2O]-，以及化学键断裂后得到m/z289.072 3 [M-H-C15H12O6]-、m/z205.050 3[M-H-C15H12O6-2（C2H2O）]-等特征碎片。参照负离子模式下的质谱准分子离子峰及特征碎片，再比对相关文献[16]可确定该化合物是黄酮类化合物原花青素B2。其二级质谱图见图5，裂解规律见图6。

图5 原花青素B2的二级质谱图

图6 原花青素B2的质谱裂解途径

化合物35的tR为6.98 min，可观察到准分子离子峰m/z593.152 0 [M-H]-，同时可以观察m/z285.040 6[M-H-C11H20O6]-、m/z255.030 0[M-HC11H20O6-CH2O]-、m/z227.035 0[M-H-C11H20O6-CH2O-CO]-、m/z163.039 4[M-H-C21H18O10]-、m/z145.028 6[M-H-C21H20O11]-等特征碎片。参照负离子模式下的质谱准分子离子峰及特征碎片，再根据相关文献[8]可确定该化合物是黄酮类化合物忍冬苷。其二级质谱图见图7，裂解规律见图8。

图7 忍冬苷的二级质谱图

图8 忍冬苷的质谱裂解途径

3.2.2 有机酸类成分解析 以化合物24为例，其tR为4.63 min，可观察到准分子离子峰m/z353.088 1[MH]-，同时二级裂解图谱可见m/z191.055 7[M-HC9H6O3]-、m/z179.034 4[M-H-C7H10O5]-的碎片离子，提示酰氧键产生了断裂，产生了奎宁酸和咖啡酸的碎片，2个碎片随后发生进一步裂解失去H2O或CO2产生了m/z173.044 9[M-H-C9H6O3-H2O]-、m/z155.034 0[M-H-C9H6O3-2H2O]-、m/z137.023 7[M-H-C9H6O3-3H2O]-、m/z179.034 4[M-HC7H10O5]-、m/z161.023 8[M-H-C7H10O5-H2O]-、m/z135.044 3 [M-H-C9H6O3-CO2]-等特征碎片。参照负离子模式下质谱准分子离子峰及特征碎片，再比对相关文献可确定该化合物为有机酸类化合物绿原酸[8,15]，其二级质谱图见图9，裂解规律见图10。

图9 绿原酸的二级质谱图

图10 绿原酸的裂解途径

3.2.3 三萜类成分分析 在刺梨叶中共鉴定出3 个三萜类成分，包括刺梨苷、蔷薇酸（野鸦椿酸）、委陵菜酸。以化合物47 为例，其tR为9.56 min，可观察到准分子离子峰m/z649.396 4[M-H]-，同时可以观察到明显的m/z487.343 9 [M-H-C6H9O5]-、m/z469.332 3 [M -H -C6H9O5-H2O]-、m/z457.337 8[M-H-C6H9O5-CH2O]-、m/z441.341 1[M-H-C6H9O5-H2O-CO]-、m/z425.342 8 [MH-C6H9O5-H2O-CO2]-、m/z407.333 3 [M-HC6H9O5-H2O-CO2-H2O]-等的特征碎片。参照负离子模式下的质谱准分子离子峰和特征碎片，推测该化合物是三萜类化合物刺梨苷。其二级质谱图见图11，裂解规律见图12。

图11 刺梨苷的二级质谱图

图12 刺梨苷的质谱裂解途径

4 讨论

本研究建立的UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS 可以实现快速、准确地鉴定刺梨叶中的化学成分，共鉴定化合物57 个，包括黄酮类21 个、氨基酸类12个、有机酸类10 个、多酚类5 个、三萜类3 个、植物甾醇类2 个、蒽醌类1 个、四环二萜类1 个、香豆素类1个及其他类化合物1个。基于三萜类成分在所鉴定化合物中响应较好且具有一定药理作用，同时参照中药质量标志物选取原则[30]，对刺梨叶中代表性三萜类化合物刺梨苷进行了裂解规律推导，为刺梨叶药效机制、体内代谢、质量标准研究提供参考。

本研究前期考察了提取溶剂（水、50%甲醇、75% 甲醇、甲醇）、提取时间（1.0、1.5、2.0、3.0 h）、稀释倍数（5、10、15 倍），对提取方法进行了筛选。结果表明，采用75%甲醇水浴回流2 h提取、稀释10 倍进样，得到的色谱峰信息较多，各分析物响应也较好。

通过对比分析刺梨叶同科植物成分分析的研究可知，在蔷薇科大部分药用植物中均含有黄酮、三萜及有机酸类成分。例如，刺玫果为蔷薇科蔷薇属植物山刺玫R.davuricaPall.的干燥成熟果实，主要含有芦丁、金丝桃苷、橙皮苷、槲皮素等黄酮类物质，其中黄酮类化合物含量相对较高[31]。徐艳春等[32]发现同为蔷薇科蔷薇属的植物金樱子中含有鞣质、皂苷、三萜等多种化合物，其中三萜类成分的含量很高，并且具有一定的药理作用，故建议将其作为质量控制的指标之一。蔷薇科植物山楂中含有多种有机酸类成分，谢颖等[33]建立了基于蒸发光散射检测器（ELSD）的高效液相色谱法（HPLC），对山楂中的熊果酸和齐墩果酸进行了含量测定。有研究发现蔷薇科植物的果实常具有“酸”的药性，如刺梨果、乌梅、金樱子和覆盆子等，而有机酸类成分常被认为是“酸”性中药的重要物质基础[34]。

刺梨叶中的主要活性化学成分为黄酮、多酚、有机酸和三萜等类化合物。黄酮类化合物药理作用主要与降血糖、调血脂、抗炎、抗过敏、抗肿瘤有关[35]。儿茶素及其类似的具有黄酮母核的化合物显示出抗氧化、保护心血管、神经保护、调节糖脂代谢等药理作用，在抗氧化损伤方面也体现出独特优势[36-39]。多酚类物质同样具有抗氧化损伤、预防2 型糖尿病、调节脂代谢等药理作用[40-41]。研究表明，植物提取物鞣花酸可直接清除活性氧自由基，抑制氧化应激、强抗氧化酶活性及基因表达，减少DNA 损伤[42]。植物甾醇如β-谷甾醇可通过促进胆固醇的降解代谢、抑制胆固醇的生化合成达到预防动脉粥样硬化的作用。此外，β-谷甾醇还具有抗炎、抗病毒、调节体内激素和调节代谢的作用[43-44]。三萜类化合物是一类具有多种生物活性的天然产物，具有抗炎、抗菌、保护肝肾、降血糖和抗肿瘤等药理作用[45]。本研究从刺梨叶中解析出的三萜类成分刺梨苷通过抗氧化作用能够明显改善大鼠脑部组织的损伤，降低血清丙二醛水平，提升血清超氧化物歧化酶含量，从而改善急性高原缺氧症状，其抗氧化损伤方面的药理作用或可对临床应用产生新的价值[46]。由以上几种存在于刺梨叶中的主要活性成分的药理作用可以看出，刺梨叶的药理作用可能不仅局限于简单的消食功效，其在抗氧化和调节代谢方面也能发挥一定疗效，有待深入研究。