供体巨噬细胞在心脏移植中的研究进展

陈远洋 王志维

(武汉大学人民医院心血管外科，湖北 武汉 430000)

近期研究表明，中国年龄≥35岁的居民心力衰竭(心衰)患病率为1.3%，即大约有1 370万人患心衰。上一次中国全国性的心衰流行病学调查是2000年，当时的调查结果[1]显示，在35～74岁的人群中，慢性心衰的患病率为0.9%，男性和女性心衰患病率分别为0.7%和1.0%。自从1967年第一例心脏移植手术成功以来，心脏移植一直是心衰晚期患者的最佳治疗方法。由于心脏移植的需求不断增加，如何扩大供体器官库和增强免疫相容性已成为心脏移植亟需解决的问题[2]。

当前对于移植后免疫抑制的策略是总体上抑制受体的全身免疫反应，这会直接导致许多并发症的发生。如何平衡同种异体移植保护及防止感染和恶性肿瘤的发生是一个极具挑战性的问题[3]。之前的研究结果表明在临床上需探索更好的替代方案，在减少排斥反应的同时也能提高同种异体移植存活率。

最近研究发现，巨噬细胞具有不同的发育起源，由不同的细胞类型组成。已有一些研究[4]调查了巨噬细胞在实体器官移植中的作用。巨噬细胞在诱导同种异体移植损伤和促进同种异体移植存活中具有矛盾作用，这些相反的功能反映了单核细胞和巨噬细胞的复杂和动态变化。心脏内的巨噬细胞可最初分为组织常驻巨噬细胞和浸润单核细胞衍生的巨噬细胞。在移植的情况下，巨噬细胞的分群极有讨论的意义，因为组织常驻巨噬细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞分别来自供体和受体。现全面讨论心脏组织常驻巨噬细胞的组成，分析讨论组织常驻巨噬细胞的功能，并强调组织常驻巨噬细胞在同种异体移植排斥和耐受中已知和推测性的作用。

1 心脏移植后的巨噬细胞种群及其功能

心脏包含不同的巨噬细胞种群，其起源和功能不同。根据CC趋化因子受体2(CC chemokine receptor 2，CCR2)的表达，来区分出心脏组织中的巨噬细胞。在正常条件下，成人心脏主要含有CCR2+MHCⅡ+巨噬细胞、CCR2-MHCⅡ+巨噬细胞以及CCR2-MHCⅡ-巨噬细胞[5]。单核细胞与心脏巨噬细胞的不同在于，其表面的CCR2高表达和MHCⅡ低表达，并且缺乏Mer受体酪氨酸激酶。CCR2-巨噬细胞来源于胚胎造血祖细胞，在胎儿发育过程中植入心脏，寿命长，并且在整个过程中都与单核细胞输入无关，通过局部扩散来维持发展。CCR2-巨噬细胞可通过分泌白介素(interleukin，IL)-10和转化生长因子-β来促进冠状血管生成，心肌细胞增殖，并且CCR2-巨噬细胞能抑制中性粒细胞和单核细胞募集[6]。CCR2+巨噬细胞来自循环单核细胞，定位于心脏，并通过逐渐募集单核细胞和局部增殖而得以维持。CCR2+巨噬细胞可促进中性粒细胞和单核细胞募集。消除CCR2+巨噬细胞可减少心肌梗死后的梗死面积和不良的心脏重构。

移植的心脏包含由供体来源的CCR2+和CCR2-巨噬细胞以及受体来源的嗜中性粒细胞、单核细胞、单核细胞衍生的巨噬细胞和单核细胞衍生的树突状细胞。经典的受体单核细胞来自血液中游离的单核细胞，并分化为巨噬细胞和树突状细胞，将促进免疫排斥反应。在鼠模型中，可使用细胞追踪技术、同基因(CD45.1/CD45.2)或分子标志技术，将供体与受体细胞分开。通过分析性别或等位基因HLA表达，也有可能在人类中区分供体和受体免疫细胞。例如，分析心内膜活检样本(移植后平均8.8年，无主动排斥反应，同种异体移植功能正常)，在女性供体被移植到男性受体中，供体与受体的起源是基于“Y”染色体的存在或不存在[7]。结合原位杂交和免疫染色揭示了很小比例的CCR2-巨噬细胞(<2%)中存在Y染色体。相反，在30%的CCR2+巨噬细胞中检测到Y染色体，表明心脏CCR2+巨噬细胞代表了供体和受体衍生细胞的集合。关于供体和受体来源的CCR2+巨噬细胞在人类功能上是否有所不同所知甚少[8]。但小鼠研究表明，与供体来源的CCR2+巨噬细胞相比，受体来源的CCR2+巨噬细胞表达较高水平的炎症趋化因子(CXCL11、CXCL2、CCL2、CCL7和CCL19)、细胞因子(IL-1β和IL-10)和不良的心脏重构基因(AREG、EREG和GDF3)[9]。供体来源的CCR2+巨噬细胞则表达更高水平的干扰素反应基因。总之，驻留在供体心脏内的巨噬细胞存在于移植物中的时间较长，且供体巨噬细胞构成及功能具有独特性，可能有助于同种异体移植的存活及预后。

2 供体巨噬细胞在缺血再灌注损伤和原发性移植物功能障碍中的作用

器官移植过程中的一个关键目标是最大程度地缩短缺血时间，缺血时间与心脏移植后的临床结果紧密相关。缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)被认为是原发性移植物功能障碍的主要诱因，是早期同种异体移植物功能丧失及死亡的主要原因。最近，器官共享联合网络修改了心脏供体的分配系统，以促进更广泛的器官共享并增加对患病个体的分配[10]。尽管尚无全面数据，但由于供体和移植中心间的距离增加，会明显延长同种异体移植的缺血时间。

已有研究[11]观察到心肌细胞死亡是由于受体大量中性粒细胞、单核细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞浸润到供体心脏中。此外，IRI后驻留在供体心脏内的巨噬细胞群会调节移植物的炎症发生和发展。移植后，供体心脏中驻留的CCR2+巨噬细胞的消耗减少，导致受体中性粒细胞外渗减少和单核细胞募集到心脏中[11]。在这种情况下，供体CCR2+巨噬细胞通过Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)9和髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依赖性机制调控中性粒细胞和单核细胞趋化因子的生成来控制受体白细胞募集。相反，来自供体心脏的组织驻留CCR2-巨噬细胞的耗竭导致受体中性粒细胞、单核细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞募集显著增加。这些研究结果显示供体巨噬细胞在IRI后同种异体移植炎症中的重要性，在移植前对供体巨噬细胞进行预处理可改善IRI相关的同种异体移植损伤，并降低原发性移植物功能障碍的发生率和严重程度[12]。

那么供体巨噬细胞是如何改善IRI及免疫排斥的呢？首先，从损伤或濒死的细胞中释放损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)和警报蛋白被认为是将IRI与免疫细胞活化联系起来的信号。细胞坏死和铁死亡是DAMP和警报蛋白释放后引起细胞死亡的主要形式，虽然之前认为坏死主要与同种异体移植免疫细胞的活化有关，但越来越多的证据表明，IRI后继发的心肌细胞和心肌成纤维细胞死亡的最初原因是铁死亡。用ferrostatin-1(铁死亡的特异性抑制剂)治疗供体心脏可显著减少初始心肌细胞和成纤维细胞死亡，并抑制早期中性粒细胞移植物的浸润[13]。

由肥大性心肌细胞和成纤维细胞释放的DAMP/警告蛋白的确切作用仍未明确，但可能与TLR结合相关。供体内皮细胞中TLR4的缺失可防止嗜中性粒细胞黏附于静脉内皮细胞，这是嗜中性粒细胞外渗的关键上游步骤。在供体巨噬细胞中消除TLR9和MyD88不会影响嗜中性粒细胞对内皮细胞的最初黏附，但会导致其跨内皮迁移能力受损[14]。这些发现显示了通过死于心肌细胞释放的DAMP/警告蛋白，向多种供体驻留细胞类型(包括内皮细胞和巨噬细胞)发出信号，并引发同种异体移植炎症的可能性。需进一步的研究来揭示IRI诱导的同种异体移植炎症和同种异体移植功能障碍的信号传导机制。

3 供体巨噬细胞和同种异体排斥反应及移植耐受性

考虑到巨噬细胞能长久驻留在移植后的心脏中，因此供体巨噬细胞可能促进同种异体移植排斥。越来越多的研究[15]表明，巨噬细胞在急性细胞性排斥反应(acute cellular rejection，ACR)和抗体介导的排斥反应(antibody-mediated rejection，AMR)中均有重要作用。在ACR中，巨噬细胞通过细胞因子和活性氧的产生来促进移植物损伤和心肌纤维化。CD16+单核细胞被认为是促进肿瘤坏死因子-α和IL-1β表达升高的强刺激因素。与浸润性单核细胞的升高一致，观察到循环中的CD16+单核细胞中HLA-DR和CD54的表达增加，表明其活化状态具有增加的迁徙潜力[16]。尽管认识到在ACR期间巨噬细胞会积累在同种异体移植物中，但对巨噬细胞亚群及其起源尚未了解。AMR的标志是嗜中性粒细胞和巨噬细胞在血管周围和血管内的蓄积，临床诊断是根据血管内CD68+单核细胞/巨噬细胞的组织病理学来确定[17]。巨噬细胞在急性AMR中导致心脏同种异体移植的损伤，主要表现为促炎表型的血管内单核细胞/巨噬细胞促进抗原加工/呈递，细胞因子产生和组织重塑。

移植免疫学的金标准是移植接受度或耐受性。目前免疫耐受性主要针对T淋巴细胞(T细胞)，因其在移植排斥中的重要作用，但亦有大量证据表明巨噬细胞亚群有助于免疫耐受。Braza等[18]的研究结果表明，移植物会大量浸润巨噬细胞表达模式识别受体Dectin-1和TLR4(响应DAMP)，当敲除对应蛋白的基因后，可降低受体炎性巨噬细胞的数量，并促进移植耐受性。同时在该模型中，需通过抑制CD40(T细胞受体)的共同阻断来诱导长期耐受，这表明T细胞可能会调节巨噬细胞表型。

有研究[19]表明，供体单核细胞和巨噬细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的敲除可增加移植物中Foxp3+调节性T细胞数量，同时增加同种异体移植物的存活时间以及减少心肌或血管损伤。Braza等[18]使用高密度脂蛋白纳米生物学靶向mTOR靶标(mTOR-HDL)，能更选择性地靶向髓样细胞并抑制T细胞增殖，诱导免疫耐受性的Foxp3+调节性T细胞增殖，并能促进产生耐受型巨噬细胞。从机制上讲，mTOR缺陷的移植物浸润巨噬细胞上调程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1，PD-L1)，而PD-L1上调阻止了移植物的急性排斥。尽管这些发现确定了单核细胞和巨噬细胞在建立同种异体移植耐受中的作用，但供体巨噬细胞的确切作用仍有待阐明。

4 供体巨噬细胞作为治疗目标

很少有研究表明减少巨噬细胞活化或抑制其效应机制可减轻IRI和排斥反应并提高同种异体移植的存活率。尽管在供体和受体来源的巨噬细胞的确切功能方面存在很大差异，但研究数据确实表明，操纵供体巨噬细胞亚群可证明是有效的。如果确实必须将供体亚群作为靶标，那么CCR2+巨噬细胞将成为心脏移植的首选靶标[20-21]。这些炎性细胞可被靶向短肽的纳米颗粒、标准单克隆抗体(即MLN1202)或新型构建体(如双特异性或多特异性抗体)靶向治疗，这些试剂可通过效应T细胞或自然杀伤细胞活化来促进消除炎性细胞[22-23]。此外，它们还可用于抑制特定细胞类型(如供体CCR2+巨噬细胞)上的细胞信号传导。

开发在移植前直接用于供体器官的疗法(在冷藏或常温灌注过程中)具有巨大的研究前景。此类药物可将与全身免疫抑制有关的风险降至最低，包括威胁生命的感染和恶性肿瘤[24]。针对引发同种异体移植炎症和排斥的浸润性单核细胞和巨噬细胞的靶向应用治疗方法，可能比目前阻止下游炎症机制的方法更具优势。

5 结论与展望

从IRI到同种异体移植排斥和耐受，巨噬细胞涉及移植的许多方面。在过去的几年中，范式转换研究提供了关于巨噬细胞多样性和功能重要性的研究证据。如今正在探索供体巨噬细胞与受体单核细胞和单核细胞衍生巨噬细胞之间的差异作用和相互作用。这些研究提出了在移植前靶向供体巨噬细胞可能是改善移植结果途径的可能性。靶向供体巨噬细胞需全面了解供体和受体巨噬细胞在同种异体移植整个生命周期中的作用。在这一领域，认识还存在很大局限，要解决的关键问题包括：不同的心脏巨噬细胞亚群在排斥和长期同种异体移植耐受中的作用；介导心脏巨噬细胞激活和单核细胞分化的机制；供体和募集的单核巨噬细胞如何相互作用；免疫系统是否会影响移植结果。解决这些问题将为安全有效的免疫抑制带来新的希望和目标。