生物材料介导骨免疫调控的骨形成及成骨机制

王 信，黄 蓉，肖 殷

(1.遵义医科大学附属医院 骨科，贵州 遵义 563099，中国；2.美国杜克大学 骨科研究中心，北卡罗来纳州 达勒姆市，27701，美国；3.昆士兰科技大学 骨组织工程研究中心，昆士兰 布里斯班，4059，澳大利亚)

骨形成过程中会伴随多种细胞的作用(如成骨细胞、血管内皮细胞、免疫细胞等)，其中成骨细胞是骨形成的主要细胞，破骨细胞刺激骨的吸收，内皮细胞负责血管的形成(新生血管的长入积极促进成骨)。虽然每种细胞都在骨形成中发挥独立作用，但免疫系统强的旁分泌作用会影响到上述所有细胞，免疫系统与骨骼系统之间的串扰形成了新的研究方向，即骨免疫学[1]。在过去的几十年里，研究者们发现生物材料能引起巨噬细胞发生极化效应，且极化后的巨噬细胞会进而影响到后序的骨形成，因此，本文重点关注巨噬细胞诱导的骨免疫调控作用及机制。随着各种生物材料在骨组织工程学中的大量运用，材料界面和细胞之间的各种生物活动也成为了热点研究领域。而在生物材料-免疫系统的交叉反应中，研究发现材料的化学物理特性也可以在损伤部位引发炎症反应，炎症反应又会对骨形成产生积极(骨折早期炎症阶段释放细胞因子促进成骨细胞生成等)或消极(白介素1、TNF-α促进破骨细胞生成等)的影响。因此，详细讨论了如何利用生物材料调节免疫系统来控制骨形成中各种事件，如成骨细胞产生和破骨细胞的发生。旨在更好地理解生物材料与骨免疫系统的关系，避免产生不良的炎症反应及破骨细胞形成的刺激。

1 生物材料与骨免疫

1.1 生物材料植入引起免疫反应 过去认为作为骨替代物的生物材料是可以触发宿主免疫的异物，故设计材料时都在通过制造惰性材料来最小化免疫反应[3]。然而近几年骨免疫学的提出，拓展了生物材料的应用范围。研究发现生物材料的特性(如外形、粗糙度、孔隙率、孔隙大小、亲水性、表面电荷等)都可以对免疫反应产生影响，从而干扰骨骼系统[4]。因此，目前的骨组织工程方法更加侧重于生物材料的表面特性，它可以在骨组织再生过程中调节各种反应的发生发展(如免疫反应、凝血反应、炎症反应等)。生物材料表面合理设计的目的是为了更好地发挥其生物相容性，以致和宿主骨组织能更好地结合在一起[4]。

生物材料植入会引发宿主的反应，包括蛋白质的吸附、免疫细胞的招募以及细胞因子的分泌[5]。材料植入后，蛋白质和补体因子会迅速吸附到材料表面，形成富含细胞因子和金属蛋白酶(MMP)的血凝块，随后招募中性粒细胞[6]。随后单核细胞聚集并分化成为有活性的巨噬细胞，巨噬细胞会分泌各种炎症和抗炎细胞因子，并且黏附到材料表面形成纤维蛋白基质，将生物材料吞噬清除[7]。骨的愈合开始于炎症反应阶段，一旦植入材料无法被巨噬细胞吞噬时，会导致炎症反应延迟，并且纤维蛋白会包裹到材料表面将其与周围组织隔离开来，导致植入失败[8]。因此骨生物材料植入后发挥的效应，很大程度上取决于免疫反应。

1.2 巨噬细胞的作用与极化 巨噬细胞不仅是天然免疫的重要组成成分，而且在骨形成过程中也起到关键作用[9]。研究表明巨噬细胞和间充质干细胞的相互作用能影响骨愈合，并且由巨噬细胞发生极化反应后，能显著加速或抑制骨组织的修复进程[10-11]。也有研究表明，将骨髓基质细胞和巨噬细胞共培养时，观察到碱性磷酸酶功能增强和Ⅰ型胶原蛋白水平升高，表明巨噬细胞可以促进成骨细胞分化[12]。此外，Champagne等[13]也证明包括来自于单核/巨噬细胞谱系的骨形态发生蛋白2(BMP-2)在内的成骨因子也具有诱导骨形成的作用。

巨噬细胞两种主要的分型是M1和M2型巨噬细胞通过细胞因子的分泌对骨再生部位的微环境产生影响。有趣的是巨噬细胞的两种表型可以相互转换，来适应不同微环境。M1型巨噬细胞是促炎性的，可以通过脂多糖(LPS)单独极化或者与Th1细胞因子(如INF-γ、GM-CSF)结合而极化，并产生促炎性细胞因子如IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23和TNF-α等[14]。IL-1β和TNF-α会抑制成骨细胞合成碱性磷酸盐，并抑制细胞外基质的分泌和矿化[15]。M2巨噬细胞具有抗炎和免疫调节作用，被Th2细胞因子(如IL-4、IL-13)极化，并产生IL-10、TGF-β、IL-1RA等抗炎细胞因子[14]。TGF-β通过调控下游骨形态发生蛋白(BMP)的产生，增强成骨细胞的作用[16]。而IL-1RA是IL-1的抑制剂，通过抑制IL-1的作用间接促进成骨细胞分化[17]。此外，M1和M2之比会影响到植入材料的作用，升高的M1和缺乏的M2会导致严重的异物反应和慢性炎症，免疫时间延长使得组织愈合延迟导致生物材料整合失败[18]。

2 生物材料调控骨免疫影响骨形成

近年来，生物材料对骨组织工程领域的快速发展做出了重大贡献。但由于目前对于生物材料与骨免疫系统之间缺乏必要的认识，导致生物材料很难转化为人体临床实验。骨折愈合过程往往伴随急性炎症，其中有多种免疫细胞的相互作用。而在不同的免疫细胞中，巨噬细胞不仅作用于免疫防御，它的极化状态在骨愈合中起关键作用[11]。越来越多的研究表明，巨噬细胞的极化状态对生物材料的化学物理特性高度敏感。而目前生物材料的研究进展使得我们可以很好地控制材料特性。所以可以利用生物材料介导骨免疫从而调节骨形成进程，而其对于骨形成、破骨细胞生成以及炎症的调控都有一定的作用，故研究人员可以将这些策略用于将来的骨组织工程研究。

2.1 生物材料的免疫调节 生物材料植入到体内会引起复杂的炎症反应，而这些炎症反应会触发多种生物化学信号，诱导免疫细胞招募到植入生物材料的区域。其中被招募的单核细胞被分化为巨噬细胞，黏附在植入的材料上，而不同性质的材料会影响巨噬细胞的可塑性从而影响骨愈合过程[19]。研究表明，生物材料引起的免疫反应可能是由于材料与各种蛋白质之间的相互作用，不同的材料可能改变蛋白质吸附的类型、浓度和模式等，从而导致蛋白质构象发生变化[19]。此外，Hu等[20]发现植入生物材料中，纤维蛋白原在生物材料上的吸附和变性暴露了纤维蛋白原D域的短序列(即γ190-202、P1和γ377-395、P2)，它们与免疫细胞的整合素Mac-1相互作用，使其产生促炎症反应。而可溶性纤维蛋白原没有这种效应。这表明免疫细胞的粘附受体与这些粘附蛋白之间的相互作用是各种信号级联的主要介质。

研究表明植入材料的生物、物理、化学特性具有调节巨噬细胞反应的能力。如从透明质酸中提取的生物材料具有很好的抗炎特性[21]。硫酸海藻酸盐促进人THP-1单核细胞的M2样极化，并抑制其它促炎性细胞因子的产生[22]。此外，生物材料表面的化学修饰可以影响蛋白质的吸附和免疫细胞下游信号的传导。研究发现，碳纳米离子体表面与碳、氮和氧官能团聚合，氧官能团的存在增加了巨噬细胞的粘附性和激活[23]。而具有亲水性/中性表面的聚对苯二甲酸乙二醇酯膜会抑制巨噬细胞的黏附和融合，但这些巨噬细胞比疏水和亲水性/离子物质产生更多的细胞因子和趋化因子[24]。这表明各种化学特征如官能团类型、表面电荷、亲水性等都对免疫反应有着重要影响。

2.2 生物材料调控巨噬细胞影响骨形成 巨噬细胞在骨再生进程中发挥重要作用，M1和M2型巨噬细胞通过分泌细胞因子影响骨再生部位微环境，控制骨髓干细胞分化和成骨细胞的功能[25]。许多研究利用生物材料控制成骨细胞调节骨再生，同时也有许多研究使用生物材料通过免疫调节增强骨形成。但由于细胞因子的复杂特性，研究主要集中于使用材料控制巨噬细胞和细胞因子的传递来调节成骨细胞功能。

目前研究认为材料亲水性的增加可以增强植入物与骨的整合。Vlacic-Zischke等[26]发现亲水性Ti测得TGF-β/BMP信号水平升高，并且在10% 过氧化氢溶液中制备亲水Ti盘24 h后，测得小鼠RAW264.7巨噬细胞的生长明显增加。这些结果表明在亲水性表面上，成骨细胞的细胞因子受体表达有所增强。而在材料中引入亲水性也会影响巨噬细胞的活性。在对相同类型的巨噬细胞研究中，Hamlet等[27]发现在亲水性Ti上培养，巨噬细胞中促炎细胞因子(如TNF-α、IL-1α、IL-1β和趋化因子(如Ccl-2)的分泌下调。这表明材料亲水性有利于巨噬细胞发挥抗炎作用，从而增强成骨过程。

表面电荷在材料表面性能调节中也起着重要作用。Brodbeck等[28]通过改变聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)材料表面电荷，发现阴离子底物促进IL-10并减少IL-8的分泌，而阳离子底物则抑制了IL-10和IL-1RA的产生。这表明材料的阴离子表面可以促进成骨细胞的功能，而阳离子表明则抑制成骨细胞的激活。此外，近期研究使用Ca和Sr等二价阳离子修饰Ti植入物培养巨噬细胞时，发现M2巨噬细胞的标记物水平增加[29]。这表明二价阳离子表面可以增强成骨细胞的功能。此外，研究发现含有β-磷酸三钙(β-TCP)的镁可以加速巨噬细胞分泌BMP-2和IL-1RA，并且在镁-磷酸钙水泥(MCPC)上的巨噬细胞分泌更多的TGF-β1和更少的TNF-α和IL-6[30]，表明可能使用生物矿化材料来增强成骨形成。因此，生物材料不仅可以直接促进成骨细胞形成，也可以影响免疫细胞来促进骨形成。

2.3 生物材料对破骨细胞形成的影响 尽管生物材料用于增强骨形成已经广泛研究，但是生物材料对破骨细胞生成的作用最近才逐渐被认识。研究表明材料表面的化学特性对破骨细胞的功能产生影响。Bang等[31]使用亲水和非亲水钛，在RNAKL和M-CSF的存在下培养巨噬细胞进行破骨细胞分化，发现所有的破骨细胞标记物如抗酒石酸酸磷酸酶(TRAP)、破骨细胞相关的免疫球蛋白样受体(OSCAR)、MFATc1和c-Fos在亲水性表面都被下调。这表明材料的亲水性增加可能降低破骨细胞活性。此外，Bose等[32]分别使用正常TCP和加入Mg2+的TCP培养破骨细胞前体RAW264.7细胞，发现加入Mg2+的没有分化为具有单核特性的破骨细胞，也没有肌动蛋白环(破骨细胞标记)的产生。这表明镁修饰表面材料也会抑制破骨细胞的生成。

研究表明材料的生物化学成分也会影响破骨细胞形成。在骨组织工程研究领域，易溶性的β-磷酸三钙(β-TCP)和难溶性的羟基磷灰石(HA)得到很多研究者的青睐。早期Yamada等[33]使用不同的HA和β-TCP比率研究材料溶解度对破骨细胞吸收的影响，发现HA/β-TCP比率为25/75破骨细胞吸收作用最强。随后，Botelho等[34]将硅结合到HA上，发现破骨细胞分化标记物表达明显升高，表明Si-HA会刺激破骨细胞形成且具有更高的破骨细胞活性。此外，也有研究发现材料表面的粗糙度也会影响破骨细胞形成。如粗糙的喷砂钛表面TRAP活性和破骨细胞数量明显高于抛光表面。Brinkmann等[35]发现钛的酸蚀刻和喷砂/酸蚀刻表面上形成的破骨细胞与原生破骨细胞形成相似，而光滑的表面上观测到的破骨细胞数量大大减少。所以破骨细胞的形成可以通过材料修饰来调节，同时也会被材料表面的粗糙度影响。而在亲水性表面，破骨细胞分化会被下调。因此，了解材料对破骨细胞的影响会有助于我们设计出成骨性能更突出的生物材料。

3 展望

随着对骨免疫系统的深入研究以及免疫系统和骨骼相互影响的新发现，使得我们对骨免疫学领域的了解迅速提升。近年来对生物材料和骨免疫系统的研究发现，极化的巨噬细胞不仅可以单独促进成骨，而且其与生物材料的作用也对成骨形成产生积极的影响。此外，材料的化学特性(如亲水性，表面电荷等)和物理特性(如粗糙度、形状、孔隙率和孔隙大小等)都会通过骨免疫系统从而影响骨形成。

目前生物材料的研究方向主要致力于通过材料的表面修饰来微调免疫系统，以期通过调控免疫细胞及其分泌的多种细胞因子，如TNF、IL-6、IL-1等[36]，来更好更快地帮助骨形成进程。但针对一些复杂的、多因素的、多重感染的骨感染临床病例，我们仍任重道远，研发具备抗多重感染能力的功能性生物材料仍然是骨科医生面临的一大难题。