甲基化分析在6种中药多糖结构表征中的研究进展

姜浩，高佳宁，李野，梁军，夏永刚

(黑龙江中医药大学 教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)

夏永刚(1980-)，男，博士，教授，博士生导师，主要研究方向：中药多糖化学与中药药性理论创新研究。

中药多糖是具有多种生物活性和药理作用的生物大分子，其结构研究一直以来是多糖研究的难点。甲基化分析是研究中药多糖结构的重要方法，它广泛用于低聚糖和多糖中单糖苷连接方式的分析。其主要过程是在温和的碱性条件下进行甲基化，然后多糖通过三氟乙酸水解得到单糖，进一步还原乙酰化衍生，通过GC-MS测定部分甲基化阿尔迪醇乙酸酯衍生物的种类和数量，通过质谱碎片裂解就能推测出单糖残基的连接方式[1]。本文总结了甲基化分析方法在黄芪多糖、人参多糖、麻黄多糖、五味子多糖、川芎多糖和桔梗多糖结构研究中的应用，阐明甲基化分析对多糖结构鉴定的重要性，同时为其他中药多糖结构分析研究提供参考。

1 甲基化分析常用中药多糖

1.1 黄芪多糖

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，在我国主要分布在黑龙江、内蒙古、江西等地[2]，味甘，性微温，具有补气升阳、益卫固表、利尿脱毒、敛疮生肌等功效。黄芪在我国药用历史悠久，目前以黄芪为原料的中成药达200多种，是临床应用最为广泛的补益中药。

黄芪多糖(Astragalus polysaccharide,APS)是黄芪主要活性成分之一，APS有多种生物学活性,主要包括免疫调节功能、抗炎、抗肿瘤、降血糖等。结构鉴定与生物活性息息相关，结构分析就显得尤为重要。黄芪多糖是从中药黄芪中分离提纯的有效成分，主要为葡聚糖和杂多糖。林梦感等[3]微波提取制得黄芪精多糖MAPS,在确定分子量和单糖组成的基础上，对MAPS进行甲基化分析，通过GC-MS检测并与标准质谱图对照，确定MAPS的连接方式为α-D-Glc(1→,→4)-α-D-Glc-(1→,→4,6)-D-Glc-(1→,且三者的摩尔比为1.0∶5.6∶1.0。需要指出的是,由于GC-MS并不能分析出酸性糖的苷连接，因此往往需要先对酸性多糖进行还原，将其中的酸性糖还原成中性糖，再进行甲基化分析和GC-MS检测。YANG等[4]在黄芪中提取分离纯化得到一种低分子量的黄芪多糖LMw-ASP，酸性杂多糖通过先还原再进行甲基化的分析方法，确定了LMw-ASP的连接方式为Glc(1→,→2)-Ara-(1→,→2)-Xyl-(1→,→4)-Glc-(1→,→6)-Glc-(1→,→3,4)-Gal-(1→,→2,4)-Glc-(1→,→3,5)-Ara-(1→,→4,6)-Gal-(1→,→3,6)-Gal-(1→,对比还原前后甲基化产物摩尔比的变化可以确定其中GalA的连接方式为→3,6)-GalA-(1→,→4,6)-GalA-(1→。范信晖等[5]通过甲基化分析两种单体多糖APS-Ⅰ和APS-Ⅱ的GC-MS总离子色谱图，鉴定苷连接方式,APS-Ⅰ为→4)-L-Ara-(1→,→2)-D-Gal-(1→,→4)-L-Rha-(1→,→6)-D-Glc-(1→,→6)-D-Gal-(1→和→4)-D-Glc-(1→;APS-Ⅱ单糖残基连接方式为→4)-L-Ara-(1→,→3,4)-D-Gal-(1→,→6)-D-Gal-(1→和→4)-D-Glc-(1→。作为一种有效的分析方法，甲基化的分析结果同样与文献报道的其他确证结构的分析方法如FT-IR和NMR分析的结果相互印证[6]。

1.2 人参多糖

人参为五加科植物人参PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根茎，在我国主要分布于辽宁东部、吉林东半部和黑龙江东部。人参在我国有悠久的药用历史，有“百草之王”的称号，也是著名的“东北三宝”之一[7]。人参含有多种有效成分，如皂苷、挥发油、糖类、多肽等[8]。人参总糖含量约占人参成分的4%～6%。人参多糖由于具有多种生物活性而被多糖研究者所研究和报道，通过甲基化分析对其多糖结构的鉴别和表征也有很多。其甲基化分析得到的连接方式大致分为中性糖和酸性果胶两大类。

人参多糖的结构研究已有大量的信息。TOMODA等[9]从人参根多糖中分离得到2个酸性糖Ginsenan PA和Ginsenan PB。先通过羧基还原成相应中性糖再进行甲基化分析，确定了Ginsenan PA和Ginsenan PB的连接方式，Ginsenan PA为L-Araf-(1→,→5)-L-Araf-(1→,→2)-L-Rhap-(1→,D-Glcp-(1→,D-Galp-(1→,→3)-D-Galp-(1→,→4)-D-Galp-(1→,→6)-D-Galp-(1→,→3,6)-D-Galp-(1→,且还原后的摩尔比为9∶2∶1∶1∶1∶4∶6∶6∶11;Ginsenan PB的连接方式为L-Araf-(1→,→5)-L-Araf-(1→,→2)-L-Rhap-(1→,D-Glcp-(1→,D-Galp-(1→,→4)-D-Galp-(1→,→6)-D-Galp-(1→,→3,6)-D-Galp-(1→,且还原后的摩尔比为4∶8∶8∶4∶1∶32∶18∶9。通过摩尔比的变化可以确定酸性糖连接为→4)-D-GalA-(1→,甲基化的反应原理虽然简单，但是操作过程复杂且反应步骤很多，往往需要反复甲基化才能实现结构的确证。TIAN等[10]从人参中获得了均一多糖级分SB1-1，通过甲基化分析表明其主要由Gal和GalA组成,是一种富含HG结构的人参果胶多糖，主链为→4)-GalA-(1→,侧链为→4)-D-Galp-(1→,GalA Gal的O-6位连有→6)-D-Galp-(1→,→3,6)-D-Galp-(1→。ZHANG等[11]从人参多糖中分离得到了一种鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(RG-Ⅰ)果胶WGPA-2-RG，并对其结构进行了甲基化分析。结果表明WGPA-2-RG连接方式为L-Araf-(1→,→3,5)-L-Araf-(1→,→5)-L-Araf-(1→,Arap-(1→,→3,6)-D-Galp-(1→,→3)-D-Galp-(1→,→6)-D-Galp-(1→,D-Galp-(1→,→2,4)-L-Rhap-(1→,→2)-L-Rhap-(1→,L-Rhap-(1→,且摩尔比为19.7∶18.1∶14.6∶0.5∶20.1∶10.7∶5.9∶5.7∶3.2∶0.7∶0.4。在WGPA-2-RG发现了大量的阿拉伯糖残基，与一些Ⅱ型阿拉伯半乳聚糖(AG-Ⅱ)类似。WGPA-2-RG是一种RG-Ⅰ型果胶，以Rha和GalA交替的主链和AG-Ⅱ长侧链。而AG-Ⅱ长侧链由→3)-D-Galp-(1→为骨架结构，和Gal的O-6位上阿拉伯糖和半乳糖取代基组成，通过鼠李糖四位碳连接到主链上。WGPA-2-RG的结构鉴定为其免疫活性功能发挥奠定了基础。

1.3 麻黄多糖

麻黄是麻黄科麻黄属植物。麻黄科只有麻黄属，麻黄属植物已知近50种，主要分布于北温带和南美的部分温带地区[12-15]。2010年版《中国药典》收载麻黄具有发汗散寒、宣肺平喘、利水消肿的功效，收载的品种为麻黄科植物草麻黄EphedrasinicaStapf.中麻黄EphedraintermediaSchrenk et C.A.Mey.或木贼麻黄EphedraequisetinaBge.的干燥草质茎。

多糖是麻黄中的主要有效成分之一，麻黄多糖具有免疫调节、清除自由基、降血糖等多种药理活性。而对其化学结构的研究就更重要。现阶段关于麻黄多糖研究报道主要集中于分析多糖含量的测定以及提取工艺的研究，而对麻黄多糖甲基化分析连接方式的文献报道并不多。随着麻黄多糖更多药理作用的发现，相信会有更多关于麻黄多糖化学结构的报道。已有文献关于麻黄多糖甲基化的报道，如KUANG等[16]从麻黄根中分离纯化得到一种酸性多糖ESP-B4，通过甲基化分析结合部分酸水解等分析方法，阐明了麻黄多糖ESP-B4的化学结构，ESP-B4的连接方式为→5)-Araf-(1→,→3,5)-Araf-(1→,α-Xylp-(1→,→3)-Xylp-(1→,→2)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,Glcp-(1→,Manp-(1→,→4)-Manp-(1→,Galp-(1→,→3)-Galp-(1→,→4)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,→4,6)-Galp-(1→,→4)-GalpA-(1→,→3,4)-GalpA-(1→,→4)-GlcpA-(1→,且摩比为3.6∶2.8∶1.0∶0.2∶1.2∶2.8∶1.7∶0.8∶0.8∶2.2∶1.1∶1.5∶2.6∶1.8∶55.2∶18.6∶2.1。酸性糖同样是先将ESP-B4进行羧基还原再甲基化的分析而确定连接和摩尔比。ESP-B4包含→4)-GalpA-(1→,→2)-Rhap-(1→连接，表示其为毛发区骨架，以阿拉伯聚糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸为侧链。果胶中GlcA并不常见，通过鼠李糖残基O-4和半乳糖醛酸O-3与主链连接。XIA等[17]进一步研究麻黄多糖，并从麻黄根中分离纯化得到一种阿拉伯聚糖ESP-B1H，甲基化分析明确了ESP-B1H的精细结构，其重复结构单元中各种糖残基的比例为→5)-α-Araf-(1→,→3,5)-α-Araf-(1→,α-Araf-(1→,→3)-α-Araf-(1→,→2,5)-α-Araf(1→,摩尔比为10∶2∶3∶2∶1,以→5)-α-Araf-(1→作为主链的骨架结构，在其O-2和O-3位有分支点。关于麻黄多糖结构方面的文献欠缺还有待深化。如果能通过甲基化分析鉴定麻黄多糖中更多的连接类型，可能会发现更多结构与功能的构效关系。值得注意的是，甲基化分析并不是独立的分析方法，它往往和其他分析方法如核磁、红外、部分酸水解等相互佐证、共同确证结构。而在这些分析方法中，甲基化分析是重要的一环，是不可忽略的。

1.4 五味子多糖

五味子为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实。五味子的果实一般为球形，多呈不规则或扁形，多呈红色，果实油润，果肉柔软，种子多呈肾形。《唐本草》记载五味子曰：“果实五味，皮肉甘、酸，核中辛、苦，都有咸味。此则五味俱也。”五味子果实味酸，性温，具有益气、敛肺、滋肾涩精、生津止渴、止泻敛汗等功能,用于久虚咳喘、久泻不止、内热消渴、心悸失眠等[18-19]。五味子的主要活性成分有木脂素、多糖、萜类等，大量研究表明五味子多糖具有保肝、免疫调节、抗肿瘤等作用[20-22]。

目前关于五味子多糖的理化性质和结构研究报道很少，国内有关五味子的结构研究主要集中在测定多糖含量、单糖组成、NMR等[23]。XU等[24]通过水提分离纯化得到两种五味子多糖(SCP),主要组分分别为SCP1和SCP2，并通过Sephades CL-6B进一步纯化SCP2，通过甲基化分析SCP2得到GC-MS质谱图，从而确定SCP2的连接方式为Galp-(1→,→4)-Galp-(1→,→4)-Glcp-(1→,→4,6)-Galp-(1→,摩尔比为3.25∶10.88∶82.62∶3.25。其中→4)-Galp-(1→,→4)-Glcp-(1→为其主要的连接方式。当然需要指出的是对于不同单糖相同苷连接的异构体，由于质谱图和特征离子相同，并不能从甲基化分析得到准确结果。目前通常是结合核磁分析等其他分析方法辅助定性。而未来如何通过总结诊断特征离子或归纳异构体的特定参数进行区分同样也是甲基化分析所面临的一个难点问题。ZHAO等[25]通过DEAE纤维素-52和Sephadex-100分离纯化得到一种新的五味子多糖SCP-22，分子量为(143±0.13)KDa。通过甲基化分析的方法结合保留时间并与文献和标准数据的质谱图进行比较，得出SCP22的葡萄糖和半乳糖的苷连接方式为Galp-(1→,→4)-Glcp-(1→,→4,6)-Glcp-(1→,且摩尔比为1.95∶16.54∶1,其中SCP22的主链是葡萄糖残基。Glc和Gal的比例(8.99∶1.00)与总单糖组成接近(8.85∶1.00),证实了甲基化分析结果的可靠性。ZHAO等[26]通过DEAE-52纤维素Sephadex G-100对五味子多糖进行提取纯化得到了一种低分子量多糖SCPP11，首次系统地阐述了SCPP11，并通过甲基化分析确定了SCP11的结构，连接方式为Glcp-(1→,→4)-Galp-(1→,→4)-Glcp-(1→,→6)-Manp-(1→,→4,6)-Galp-(1→,摩尔比为2.05∶1.27∶10.34∶1.00∶2.00,重复单元片段主要由62.34%的→4)-D-Glcp-(1→,7.85%的→4)-D-Galp-(1→,5.92%的→6)-D-Manp-(1→,11.95%的→4,6)-D-Galp-(1→组成。根据甲基化分析确定SCP11的主干→4)-Galp-(1→,→4)-Glcp-(1→,→6)-Manp-(1→,→4,6)-Galp-(1→,Gal的C-4位置有一个分支，分支由→4)-Glcp-(1→和Glcp-(1→组成。综上可以看出五味子多糖大多为葡萄糖半乳糖等六碳糖，而关于五味子多糖结构研究中半乳糖和葡萄糖的比例和连接方式一直是研究的难点，二者的相同苷连接即使通过GC-MS质谱图的比较也难以区分，大多是根据多糖研究者的经验结合文献加以判断。如何解决异构体的鉴别也是甲基化研究者所面临的问题之一。虽然关于五味子多糖的结构研究报道还不是很多，但五味子多糖含量高，制备方法简单，药理活性强。相信在未来仍有较好的发展前景。

1.5 川芎多糖

川芎为伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎，味辛，性温，具有活血止痛、行气开郁等功效。主要产于四川、云南、广西等地。在东北也有分布，称之为“东川芎”。川芎化学成分的研究已经成熟并且深入，而关于川芎多糖的研究相对来说还不够完善。

HUANG等[27]通过优化提取条件，分离纯化得到两个川芎果胶多糖LCP-Ⅰ和LCP-Ⅱ。通过凝胶过滤进一步纯化获得川芎根茎中提取的果胶多糖LCP-Ⅱ-Ⅰ。甲基化分析确定其连接方式Araf-(1→,→5)-Araf-(1→,→3,5)-Araf-(1→,→2,3,5)-Araf-(1→,Rhap-(1→,→2)-Rhap-(1→,→2,3)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,Galp-(1→,→4)-Galp-(1→,→4)-GalAp-(1→,→3,4)-GalAp-(1→,摩尔比为6.4∶5.3∶9.6∶0.9∶0.5∶2.6∶0.6∶4.2∶3.1∶16.3∶45.2∶3.5。果胶由线性高聚半乳糖醛酸(HG)区域和具有分支的鼠李糖半乳糖醛酸(RG)Ⅰ和Ⅱ区域组成。LCP-Ⅱ-Ⅰ包含→4)-GalAp-(1→的苷连接，表示其为HG区骨架。→4)-GalAp-(1→以及在3，4位上存在分支的→2)-Rhap-(1→表明RG-I在LCP-Ⅱ-Ⅰ中的存在。LCP-Ⅱ-Ⅰ中不存在AG-Ⅱ聚合物,由于其不含→3)-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,Arap-(1→的苷连接。LCP-Ⅱ-Ⅰ中1,4-Galp的高百分比表明存在AG-Ⅰ。而ZOU等[28]通过阴离子交换色谱柱分离纯化得到川芎多糖的纯化组分LCP-I-I，将分离纯化后的样品还原、甲基化、水解、还原、乙酰化后，用气相色谱-质谱法(GC-MS)对活性多糖组分LCP-I-I进行了系列分析。确定了LCP-I-I的连接方式为Araf-(1→,→5)-Araf-(1→,→3,5)-Araf-(1→,→2,3,5)-Araf-(1→,Rhap-(1→,→2)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,Galp-(1→,→4)-Galp-(1→,→3)-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,4)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,Glcp-(1→,→4)-Glcp-(1→,→4)-GalAp-(1→,摩尔比为9.4∶4.7∶11.1∶3.4∶0.5∶2.6∶2.8∶4.9∶14.1∶2.4∶1.2∶1.2∶2.4∶3.1∶12.3∶22.6。结果表明，与之前不同的是→3)-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→的存在可知LCP-I-I中还存在AG-Ⅱ侧链，LCP-I-I中的Ara有Araf-(1→,→5)-Araf-(1→,→3,5)-Araf-(1→,→2,3,5)-Araf-(1→,表明LCP-I-I中的Ara是高度支化的→5)-Araf-(1→。甲基化过程可能导致甲基化不足，因为分支点的程度略高于末端基团。这可能是由非常紧密的分子引起的，或者是由于甲基化过程中使用的溶剂溶解度低造成的。木糖是甲醇分解后少量鉴定的单糖之一。LCP-I-I中Glcp-(1→,→4)-Glcp-(1→的存在表明可能存在来源于纤维素碎片的葡聚糖聚合物。ZHANG等[29]进一步研究川芎多糖，从川芎中分离纯化得到了一种具有免疫作用的阿拉伯聚糖LCP70-2A，通过甲基化分析GC-MS检测得到LCP70-2A连接方式为L-Araf-(1→,→5)-L-Araf-(1→,→3,5)-L-Araf-(1→,→2,3,5)-L-Araf-(1→,摩尔比为7.8∶5.0∶5.7∶1.0。体外细胞实验表明LCP70-2A可以增强巨噬细胞的吞噬作用以增强免疫调节因子。甲基化分析结果表明，LCP70-2A是一种均一的阿拉伯聚糖，→5)-L-Araf-(1→为主链，L-Araf-(1→的O-2和O-3处存在分支。川芎多糖的研究国内主要集中于提取工艺的研究较多，甲基化结构表征的研究较少，随着川芎更多的药理作用被发现，相信川芎多糖的甲基化分析会有更广阔的研究价值。

1.6 桔梗多糖

桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根[18]。别名铃铛花、和尚帽等，是多年生草本植物。桔梗不仅是我国传统中药，而且还兼食、观赏、药用的珍稀经济植物。桔梗的干燥根部味苦、辛，性微温，能祛痰止咳、宣肺、排脓。多糖属于桔梗的重要活性成分且在桔梗根中的含量高达61.2%[30-31]。桔梗多糖能够显著抑制宫颈癌细胞株U-14小鼠移植瘤生长[32],在抗疲劳[33]、抑真菌[34]等方面发挥着一定的作用，有效剂量的桔梗多糖还能够对H2O2致PC12细胞氧化应激损伤起到保护作用[35]。

关于甲基化分析桔梗多糖的连接方式具有重要研究价值。PANG等[36]采用DEAE阴离子交换层析法从桔梗水提液中分离得到菊粉型果聚糖(PGF)。甲基化分析结果表明，PGF主要由Fruf-(1→,Glcp-(1→,→2)-Fruf-(1→组成，摩尔比分别为1∶2∶7。ZOU等[37]在确定单糖组成后，通过甲基化分析确定PGP-I-I糖残基之间的连接方式为L-Araf-(1→,→5)-L-Araf-(1→,→3,5)-L-Araf-(1→,Rhap-(1→,→2)-Rhap-(1→,→3)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,Galp-(1→,→4)-Galp-(1→,→3)-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,GalAp-(1→,→4)-GalAp-(1→,摩尔比为12.9∶5.6∶13.9∶1.3∶4.0∶0.6∶2.4∶2.6∶9.1∶0.9∶0.7∶1.3∶1.1∶42.1。PGP-I-I含有果胶多糖中存在的典型糖苷键。首先，由于存在较高含量的→4)-GalAp-(1→,形成了以高聚半乳糖醛酸(HG)为主的主干。从桔梗中分离纯化得到一种经鉴定仅含有1→4连接的高聚半乳糖醛酸,归属于毛发区域的典型→2)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,鼠李糖的含量表明主骨架区域大约有5%的支链附着。毛发区也被称为I型鼠李半乳糖醛酸(RG-I)，将会在鼠李糖的4位上连接由不同比例的半乳糖、阿拉伯糖组成的侧连结构。主要由1,4-Gal连接着T-Ara的链被叫作I型阿拉伯半乳聚糖(AG-I)，当半乳糖苷连接为1,3-,1,6-,1,3,6-时,是典型的Ⅱ型阿拉伯半乳聚糖(AG-Ⅱ)。AG-I约占聚合物摩尔百分含量的9.1%。末端鼠李吡喃糖也可以是该域的一部分。聚合物与Yariv试剂形成红色沉淀物，这表明PGP-Ⅱ中存在AG-Ⅱ型聚合物，也表明是基于存在的Gal键。由AG-Ⅱ组成的一小部分链连接在RG-I区域上，约占总多糖摩尔百分含量的2.9%，浅色沉淀物和低含量的1,3-连接Galp(0.9%)也证实了这一点，这对结合Yariv试剂很重要。此外，单糖组成阿拉伯糖摩尔百分含量超过了30%。阿拉伯糖链是以高支化的→5)-L-Araf-(1→为主链,在3位(13.9%)上连接着大量的L-Araf-(1→(12.9%)。该阿拉伯聚糖部分可以直接连接到RG-I区中Rha的4位，或者连接到AG-I和/或AG-Ⅱ链的Gal上。在ZOU等[28]的研究中发现的这些糖苷连接与之前只有一项对桔梗中性多糖的研究相似。发现主要构成为→4)-Galp-(1→和→5)-L-Araf-(1→，其次是少量的末端L-Araf-(1→,→3,5)-L-Araf-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,但没有GalpA。可能是纯化方法，尤其是洗脱系统不同,这可能是造成这种差异的主要因素。XU等[38]从桔梗中分离纯化得到一种水溶中性阿拉伯半乳聚糖PGAW1,经过甲基化分析得到不同的苷连接Araf-(1→,→5)-L-Araf-(1→,→3,5)-L-Araf-(1→,Galp-(1→,→4)-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,摩尔比为17.5∶25.6∶14.6∶5.7∶21.6∶6.9∶8.1。通过甲基化分析确定PGAW1的结构为→4)-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→组成主链，在主链→6)-Galp-(1→的O-3上存在分支侧链，侧链有→5)-L-Araf-(1→,→3,5)-L-Araf-(1→。L-Araf-(1→连接在→3,5)-L-Araf-(1→的O-3，而Galp-(1→可能连接在→3,5)-L-Araf-(1→的O-3上，同时也可能连接在主链→6)-Galp-(1→的O-3上。甲基化分析结果表明PAGW1分支明显，主要分支点为→3,5)-L-Araf-(1→(14.6%)和→3,6)-Galp-(1→(8.1%)。桔梗多糖结构分析是其生物活性研究的前提，而如何有效通过甲基化分析和发现更多结构类型的桔梗多糖，从而为阐明桔梗多糖的价值打下基础仍是桔梗多糖研究者的主要研究内容。

2 小结与展望

多糖是维持生命正常运转的基本物质之一，多糖研究一直是热点领域。虽越来越受到重视，但是关于多糖化学结构的研究与蛋白质和核酸相比还存在很大的差距，主要是因为多糖结构和功能的联系始终是薄弱的一环。现代多糖的提取分离技术和手段日益成熟，分离纯化所得到的多糖结构也就愈加复杂。经过一个多世纪的发展，甲基化分析方法已由克量级进入微克量级，并广泛用于多种中药多糖的结构鉴定中。

常用的甲基化分析方法有很多，Haworth、Purdie、Hakomori、Kuhn法等，这些方法虽操作不同，但是反应原理都大致相同。甲基化分析是多糖结构研究的关键环节，虽经不断改进和完善，但对于酸性多糖而言，仍不能直接准确鉴定。而未来甲基化分析如何解决现在遇到的瓶颈问题，比如异构体的鉴别和如何简化甲基化分析步骤，提高甲基化应用于各种复杂多糖的结构分析等将是甲基化分析在接下来的研究中所面临的难点。