膀胱癌肿瘤标志物检测方法的研究进展△

田玉婷，任晓委，冯小燕，贾璐璐，邹立娜，潘洪志，马宏坤#，荣胜忠#

1牡丹江医学院公共卫生学院，黑龙江 牡丹江 157011

2牡丹江医学院附属红旗医院体检科，黑龙江 牡丹江 157011

3上海健康医学院协同科研中心，上海 201318

膀胱癌是泌尿系常见恶性肿瘤之一，全球范围内，每年新发病例数高达43万例，占所有恶性肿瘤的第11位[1]，具有复发率高、预后差等特点[2]。膀胱镜检查是诊断膀胱癌的金标准[3]，但成本较高、具有侵入性[4]，且在检测原位癌时敏感性较低，具有一定的漏诊率[5]。

肿瘤标志物是由肿瘤细胞（或细胞膜表面）产生，或由机体对肿瘤产生免疫反应而生成、分泌或脱落至人体体液或组织中的物质[6]，如核酸、蛋白质、酶及糖类。肿瘤标志物在辅助肿瘤治疗、监测复发等方面发挥着至关重要的作用[7]。近年来，多种方法已经应用于膀胱癌肿瘤标志物的检测，如传感器[8]、微流控[9]、荧光原位杂交[10]、酶联免疫吸附试验[11]、流式细胞术[12]及逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）等[13]，已引起学者的广泛关注。本文对近年来膀胱癌肿瘤标志物的检测方法及研究进展进行综述。

1 传感器

1.1 DNA电化学传感器

典型的生物传感器由生物受体和换能器组成。生物受体与目标分析物相互作用，换能器将这种相互作用转化为电信号[14]。

DNA电化学传感器是通过目标DNA与捕获的寡核苷酸和识别探针相互作用，识别探针与适当的标志物相结合进而实现物质检测的一种方法[15]。

成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）属于酪氨酸激酶家族，位于染色体4p163上[16]，是评估膀胱癌患者预后的肿瘤标志物之一，也是尿路上皮性膀胱癌的有效治疗靶点[17]。

Chen等[18]将血红素包裹在金属有机框架材料（MOFs）和铂纳米粒子（PtNPs）中，制备了血红素-MOFs/PtNPs复合材料，又利用血红素-MOFs/PtNPs进行信号放大，因为这种纳米材料具有显著的H2O2催化能力和优良的导电性。为进一步放大电化学信号，选择还原氧化石墨烯-四乙基戊胺（rGOTEPA）、纳米金、链霉亲和素对电极进行修饰。在最佳条件下，该生物传感器对FGFR3在0.1 fM～1.0 nM范围内具有良好的线性关系，检出限为0.033 fM。

1.2 电化学免疫传感器

免疫传感器是利用抗原和抗体特异性识别和结合的原理设计的一种检测设备。抗原和抗体分子以某种形式固定在电极表面，并与相应的抗体或待检测抗原形成稳定的复合物。这些复合物可以引起电化学信号的变化，如电极电位、电流和电容[19]。电化学免疫传感器的灵敏度受到传感表面比表面积和电导率的影响[20]。由于具有灵敏度高、检测快速、小型化、成本低等优点，近年来得到了广泛的关注和迅速发展。

1.2.1 免标记电化学免疫传感器核基质蛋白22（nuclear matrix protein 22，NMP22）可参与DNA重组和复制、RNA转录和有丝分裂过程[21-22]，是美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准使用的膀胱癌肿瘤标志物，可以辅助膀胱癌的诊断[23]。Li等[24]以钴基金属有机框架材料（Co-MOFs）为载体，在其表面包裹铜金纳米线（CuAu NWs），合成了一种菊花状纳米复合材料（Co-MOFs/CuAu NWs），用于修饰玻碳电极。Co-MOFs/CuAu NWs作为信号材料具有优异的催化性能，基于此构建了检测NMP22的免标记电化学免疫传感器，线性范围为0.1 pg/ml～1.0 ng/ml，检出限为33 fg/ml。荣胜忠等[25]和Rong等[26]采用rGOTEPA固定金掺杂的金属有机框架材料ZIF8复合膜修饰丝网印刷电极，再将NMP22抗体固定在修饰电极表面，用牛血清白蛋白封闭，建立了免标记电化学免疫传感器检测NMP22。在最佳检测条件下，传感器的线性范围为0.01～1000.00 ng/ml，检出限为3.33 pg/ml。

1.2.2 三明治电化学免疫传感器Wu等[27]以氨基功能化的硅铝磷酸酯分子筛（NH2-SAPO-34）为载体的Pd/Co纳米颗粒（NH2-SAPO-34-Pd/CoNPs）为标记物，研制了一种新型的三明治电化学免疫传感器用于检测NMP22，线性范围为0.001～20.000 ng/ml，检出限为0.33 pg/ml。

1.3 电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）传感器

ECL传感器是电化学氧化还原反应产生的一种发光传感器，结合了化学发光和电化学的优点[28]，通过化学修饰电极来改变其表面的微观结构，从而增强传感器的灵敏度和选择性。通过电极表面特殊的修饰材料来增强ECL体系，有望扩大ECL的研究范围[29]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是由18～24个碱基对单链分子组成的小型非编码RNA[30]，通过降低靶mRNA的稳定性或抑制翻译效率调控基因表达[31]，在调控肿瘤发生发展、转移和血管生成中发挥重要作用[32]。

Xu等[33]将Hemin/g四联体DNAzyme组装在氮化碳纳米片和纳米金修饰的电极上，在过量的H2O2存在下，较低的目标浓度下Hemin/g四联体DNAzyme对H2O2的催化还原使ECL强度恢复，较高的目标浓度下电极表面生物催化沉淀（biocatalysis precipitation，BCP）诱导的电荷转移阻力导致ECL降低，基于H2O2和BCP催化还原引起的ECL的强度变化实现了膀胱癌肿瘤标志物miRNA-141的检测，线性范围为10-17～10-9M，检出限为7.9 M。Zhang等[34]以Zn-Ag-In-S（ZAIS）纳米晶为模型研究了多晶纳米晶（NCs）的ECL传感器，可溶性ZAIS NCs可以产生以三丙胺为共反应物的高效还原氧化ECL传感器，以ZAIS/ZnS NCs为标记，制备了一种超灵敏的ECL传感器，实现了膀胱癌肿瘤标志物miRNA-141的检测，线性范围为0.1～20.0 pmol/L，检测下限为50 amol/L。

2 微流控

微流控是一种精确控制和操控微尺度流体，以在微纳米尺度空间对流体进行操控的技术[35]，芯片是实现流体操控的载体[36]。微流控具有设备体积小、使用样品和试剂量少、运行成本低、检测时间短等诸多优点[37-38]。

Lin和Peng[39]建立了一种基于磁珠的免疫分析方法，在半导体传感器中嵌入微流控芯片，使用二抗标记带负电荷的DNA片段进行信号扩增，外加的磁力将分析物紧密地附着在传感器表面，从而有效解决了分析物到传感器表面距离较长的问题，进而实现载脂蛋白A1的检测，检出限为12.5 ng/ml。膀胱肿瘤抗原（bladder tumor antigen，BTA）由膀胱癌细胞产生，当肿瘤侵入间质时释放至尿液中，美国FDA已经批准其可以作为膀胱癌肿瘤标志物。BTA测试是使用单克隆抗体检测尿液中的补体因子相关蛋白，可以在数分钟内完成，无需对尿液样本进行任何预处理[40]。Jiang等[9]制备了纸基微流控分析装置，检测了尿液样本中的NMP22和BTA，结果显示该方法的检出率可达90.91%。

3 荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）

FISH是依据碱基互补配对原理，应用荧光素直接或间接标记核酸探针，在组织切片、细胞涂片、染色体铺片上检测间期细胞核染色质数量及结构的变化，进而定性和定量分析目标物的检测技术[41]。FISH作为一种分子水平检测膀胱癌肿瘤标志物的方法，具有无创、灵敏度高、易于采集等特点，临床应用前景广阔。

Riesz等[42]使用FISH技术检测尿液中尿路上皮细胞的基因突变情况，将荧光直接标记的DNA探针结合到3、7、17号染色体和9p21位点的着丝点周围，对43例膀胱癌患者和12例无或良性突变膀胱癌患者的尿液样本进行了研究，所得FISH结果与经尿道手术切除标本的组织学结果进行比较，特异度和灵敏度分别为100%和87%。Karnwal等[43]以48例膀胱癌患者为研究对象，分别比较了FISH、细胞学检查、膀胱镜检查3种方法预测膀胱癌复发的灵敏度和特异度，3种方法的灵敏度分别为63%、42%和98%，细胞学检查预测膀胱癌复发的特异度为89%，明显高于FISH检查的65%及膀胱镜检查的41%。

4 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）

ELISA是将已知的抗原（抗体）吸附于固相载体表面，加入抗体（抗原）与酶结合成的偶联物，通过加入酶底物的显色剂来确定抗原抗体结合量的方法[44]。survivin是细胞有丝分裂的重要调节因子，也是细胞凋亡的抑制因子，可以促进肿瘤细胞的增殖，诱导新生血管生成，从而增强肿瘤细胞的侵袭能力[45]，是一种新型膀胱癌肿瘤标志物[46]。Li等[47]建立了一种用于检测survivin的ELISA，检出限为0.0625 ng/ml，以0.09 ng/m（l检测波长450 nm）作为最佳截断值，诊断膀胱癌的灵敏度和特异度分别为70.6%和89.2%。Arya和Estrela[48]建立了一种新型电化学ELISA检测平台用于NMP22和补体因子H相关蛋白1（complement factor H related 1，CFHR1）的检测，NMP22和CFHR1抗体用于免疫分析，梳状金电极用于传感，线性范围为1～100 ng/ml，NMP22和CFHR1的检出限分别为260 ng/ml和310 ng/ml。

5 流式细胞术

流式细胞术是将荧光标记抗体标记的细胞通过光探测区时可以被高度聚焦的激光束检测，通过分析细胞的荧光和（或）散射特性明确细胞性质和状态[49]。流式细胞术是评估多种肿瘤标志物表达、区分细胞群及细胞亚群的有效方法[50]，广泛应用于免疫学、病毒学、分子生物学、肿瘤生物学及传染病学等多个学科。

CK20在正常膀胱黏膜移行细胞中不表达，在膀胱移行细胞癌中高表达，因此可以作为膀胱癌的肿瘤标志物。Barlandas-Rendón等[51]以115例膀胱癌患者为研究对象，采用流式细胞术分析尿液中CK20和CD45的表达，同时进行细胞学分析，阳性病例中组织学确诊21例，流式细胞术确诊18例，细胞学确诊16例，两种方法的检测灵敏度分别为85.7%和76.1%。邱莲女等[52]利用流式细胞术对良性血尿、膀胱良性肿瘤及膀胱癌患者尿脱落细胞进行DNA倍体和S期组分（S phase fraction，SPF）分析发现，膀胱癌、膀胱良性肿瘤患者的SPF明显高于良性血尿患者，提示尿脱落细胞DNA流式细胞术可以成为诊断及评估膀胱癌预后的辅助方法。

6 RT-PCR

RT-PCR通过mRNA生成互补DNA（complementary DNA，cDNA）转录本定性检测基因表达，并用荧光探针定量检测cDNA的扩增，RT-PCR的过程包括3个步骤：RNA逆转录为cDNA、PCR扩增cDNA、扩增产物检测[53]。Ribal等[54]采用RT-PCR法分析了57例浸润性膀胱癌根治术患者和9例非浸润性膀胱癌患者外周血、骨髓、淋巴结、肿瘤组织及正常膀胱组织中的膀胱癌肿瘤标志物CK20的表达情况，57例患者中有24例淋巴结阳性，56例均有CK20的表达，组织学和RT-PCR的阳性结果在95.8%的研究患者中一致，因此RT-PCR法检测CK20是一种检测浸润性膀胱癌患者循环肿瘤细胞和淋巴结残留病变的高灵敏度和特异度方法。

Kenney等[55]采用RT-PCR法检测了118例膀胱癌患者、50例有膀胱癌病史的患者、68例未确诊膀胱癌的患者和55例血尿患者尿液中膀胱癌肿瘤标志物survivin的水平，发现RT-PCR法检测膀胱癌患者尿中survivin表达的灵敏度和特异度分别为79%和93%，检测初诊膀胱癌患者尿中survivin表达的灵敏度和特异度分别为83%和95%，检测复发性膀胱癌患者尿中survivin表达的灵敏度和特异度分别为82%和90%，对血尿膀胱癌的检测灵敏度和特异度分别为80%和90%，因此RT-PCR是一种高灵敏度与高特异度、无创的survivin检测方法。

7 小结与展望

上述检测方法中，传感器具有方便、快速、灵敏、选择性高的优点，已发展成为定性、定量检测的重要手段，正向检测自动化、小型化、集成化的方向发展；微流控技术具有集成小型化、自动化、高通量、检测试剂消耗小、污染少等优点，但存在成本高、核心技术不规范等不足；FISH技术是一种具有较高灵敏度、特异度、无创的临床诊断方法，但较高的费用可能限制其广泛应用；ELISA方法具有很高的灵敏度、特异度，并且操作简单、易于标准化，但结果不稳定；流式细胞术精度高，但所用仪器价格昂贵，限制了其普及应用；RT-PCR具有灵敏、快速、特异度高等优点，但具有可重复性低、易污染等缺点。

肿瘤标志物作为肿瘤辅助诊断、治疗效果评估和预后判断的重要指标，目前得到了广泛应用。虽然检测肿瘤标志物的方法很多，但各自存在一定的缺点，目前尚无一种方法诊断膀胱癌的灵敏度和特异度达到100%，因此，通过科学开展多种肿瘤标志物联合检测和联合应用多种检测方法可以在一定程度上提高膀胱癌的检出率，提高防治的效果。

贡献声明田玉婷负责文章撰写及修改，任晓委、冯小燕、贾璐璐、邹立娜负责资料收集、整理及翻译，潘洪志、马宏坤、荣胜忠负责反复审校及润色修改。