低剂量放疗联合免疫治疗在恶性肿瘤综合治疗中的研究进展

崔羽，杨露，杜雪，谭榜宪

川北医学院附属医院肿瘤科，四川 南充 637000

肿瘤在发生发展过程中与免疫系统交互作用，机体可以通过免疫监视等[1]多种途径消除肿瘤细胞或抑制其增殖，但由于免疫逃逸机制的存在，仍难以阻止肿瘤的发生和发展。免疫系统和肿瘤细胞的交互作用可以概括为免疫清除、免疫平衡、免疫逃逸3个主要阶段[2]，这其中除了有传统免疫细胞如巨噬细胞[3]、中性粒细胞[4]等的参与，一些细胞因子如白细胞介素（interleukin，IL）-35[5]也参与了肿瘤进展的调控。而放疗可以通过促进M1型巨噬细胞的极化等多种途径促进机体免疫系统的抗肿瘤效应，使抗肿瘤效应超过原有的免疫抑制效应。近年来，关于放疗联合免疫治疗的基础研究和临床试验越来越多，大量研究表明，放疗与免疫治疗联合应用起到了良好的治疗效果。放疗作为一种局部治疗方式，对于病变广泛及有远处转移病例仍需结合全身治疗手段[6]。Lhuillier等[7]和Formenti等[8]的研究表明，放疗可激活机体免疫系统，增强肿瘤细胞的抗原性，使免疫原性突变暴露于免疫系统。放疗和免疫治疗的结合具有局部抗肿瘤和全身抗肿瘤效应的潜力，可能带来意想不到的效果[9-12]。然而，即使中等放疗剂量也可能有害于周围正常组织，可能会导致免疫抑制、肿瘤复发和（或）诱导继发性肿瘤[13-16]。在低剂量照射（短时间内吸收≤0.1 Gy或长时间暴露期间≤0.1 mGy/min剂量率）后，此类并发症极少发生。并且低剂量照射或长期照射具有抗肿瘤活性，显著抑制自发性或诱发性肿瘤的生长和（或）发展[17]。为此，研究人员通过流行病学以及动物研究发现，接受低剂量放疗可抑制或延缓原发肿瘤[18]，临床中也发现了低剂量放疗的抗肿瘤作用[19]。在35例复发及对化疗有耐药性的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）患者中，小剂量全身照射（0.10～0.25 Gy，每周2次，总剂量为1.5～2.0 Gy）联合大面积病灶的累及野放疗的完全缓解率为29%，2年无进展生存率为32%，中位无进展生存期为12个月，2年生存率为42%，中位总生存期为17个月。有学者对比了低剂量放疗联合免疫治疗、单纯放疗、单纯免疫治疗，发现低剂量放疗联合免疫治疗的综合治疗能极大地提高肿瘤的控制率[20]。本文就低剂量放疗联合免疫治疗对恶性肿瘤的综合治疗机制展开综述。

1 低剂量放疗增强免疫相关细胞活性

1.1 低剂量放疗增强 T细胞浸润

研究发现，在给小鼠接种肉瘤细胞6 h前，予以X线照射0.075 Gy，能显著降低成瘤率，且肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）明显增多[21]。同样的也有研究通过对比对照组（未进行低剂量放疗）和试验组（进行1 Gy×2次放疗）发现，进行低剂量放疗的小鼠引流淋巴结内的CD4+T细胞和CD8+T细胞明显高于对照组[22]。放疗可以通过肿瘤内的血管内皮细胞上调血管细胞黏 附 分 子 -1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）等黏附分子的表达，并诱导T细胞趋化因子的表达，从而促进T细胞黏附和渗入肿瘤微环境[23]。

1.2 低剂量放疗增强自然杀伤（natural killer，NK）细胞的活性和功能

通过对比控制组（未进行低剂量放疗）和试验组（进行1 Gy×2次放疗）发现，进行低剂量放疗的小鼠TIL中NK细胞的比例高于控制组[22]。低剂量放疗能刺激NK细胞增殖[24]，抑制其凋亡[25]，促进NK细胞的细胞毒性功能[26]。NK细胞活性增加还可能与低剂量放疗诱导谷胱甘肽的产生增加及IL-2、IL-12、γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的分泌增加有关[27-28]。

1.3 低剂量放疗增强树突状细胞（dendritic cell，DC）的活性

低剂量放疗通过激活共济失调毛细血管扩张突变蛋白（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路促进DC产生IL-12和促进DC的体外和体内迁移，从而增强DC的T细胞刺激活性和体外抗肿瘤作用[29-30]。

1.4 低剂量放疗促进 B淋巴细胞增殖

有研究发现，低剂量放疗能提高细胞周期蛋白E和细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2）的水平以及升高Ikaros蛋白（含锌指的转录因子家族成员）的磷酸化水平来增强B淋巴母细胞的增殖[31]。低剂量放疗还可以通过激活NF-κB和诱导细胞分化分子CD23的表达来调节B细胞分化[32]。

2 低剂量放疗将免疫反应向有利于抗肿瘤表型的方向转移

2.1 低剂量放疗强化肿瘤弱势抗原表位的免疫学效应

低剂量放疗可以通过降低体内CD4+CD25+叉头框蛋白P3（forkhead box P3，FOXP3）+调节性T细胞亚群，并产生记忆样T细胞，使体内淋巴细胞对肿瘤抗原的应答阈降低，免疫反应增强，诱导以Th1细胞为主的细胞免疫应答，通过肿瘤弱势抗原表位优势化发挥抗肿瘤效应[33]。

2.2 低剂量放疗促进M 1型巨噬细胞的极化

巨噬细胞发挥着两面派的作用[34]，一方面M2型巨噬细胞（也称为肿瘤相关巨噬细胞）促进肿瘤细胞的生长、血管生成、侵袭和转移[35-37]，另一方面M1型巨噬细胞可激活Th1细胞并增强T淋巴细胞浸润，以增强免疫反应[38]。通过对比进行低剂量放疗和未经照射的实验小鼠的肿瘤微环境发现，经过低剂量放疗的小鼠其M1型巨噬细胞的比例明显高于未经照射的小鼠[22]，其机制与低剂量放疗可以诱导一氧化氮合酶产生从而导致M2型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞有关[39]。

2.3 低剂量放疗促进中性粒细胞向有利于肿瘤控制的方向转变

中性粒细胞在肿瘤控制中同样充当着双面角色[40-41]。低剂量放疗能够使转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）基因表达下调[42]，也能促进IFN-γ和TNF-α的mRNA表达增强[43]，从而促进中性粒细胞向有利于肿瘤控制的类型（N1型）转变。

3 低剂量放疗改变免疫相关细胞因子活性

3.1 低剂量放疗降低TGF- β水平

通过对实验小鼠低剂量放疗（1 Gy×2次）后24 h的TIL进行Molecular NanoString分析显示，受到低剂量放疗的小鼠TGF-β1基因表达显著下调（P=0.0007）[22]。TGF-β是成纤维细胞和纤维细胞的有效激活剂[29,40,44]，也是关键的肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast，CAF）分泌因子，在促进肿瘤生长和转移中起重要作用。

3.2 低剂量放疗改变细胞因子活性

低剂量放疗增加有活性的IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF），并降低IL-10的产生[45-47]。正如Hashimoto等[48]在1999年报道的，注射同种异体肝癌细胞的大鼠在使用0.2 Gy的γ射线低剂量全身照射后其肺和淋巴结转移率明显降低，并伴有CD8+淋巴细胞进入脾脏和肿瘤部位，IFN-γ和TNF-α的mRNA表达上调，TGF-β的mRNA表达下调；在这些组织中未检测到抑制抗肿瘤Th1反应的Th2型细胞因子IL-4、IL-6、IL-10 mRNA。研究证实，低剂量放疗（75 mGy、12.5 mGy/min）在第 12天、第 16天和第20天显著诱导Th1细胞因子IL-1β、IL-2、IFN-γ和TNF-α上调，并下调IL-10的表达[46]。低剂量放疗促进脾脏免疫细胞增殖，这可能是其增强某些细胞因子活性的原因；而高剂量放疗不仅抑制脾脏免疫细胞增殖，还可抑制IL-1β等细胞因子的活性。

3.3 低剂量放疗增加某些趋化因子的数量

趋化因子可调节免疫细胞的迁移、分化和激活，一些趋化因子可募集免疫细胞（如细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞和巨噬细胞），并诱导Th1极化[49]，从而抑制肿瘤。有研究证实，在2 Gy局部照射的小鼠肿瘤中发现了与T细胞吸引有关的趋化因子[如趋化因子9、趋化因子10、趋化因子11、C-C基序趋化因子4（C-C motif chemokine 4，CCL4）和C-C基序趋化因子5（C-C motif chemokine 5，CCL5）]分泌增加[20]，这可能也是低剂量放疗增强免疫相关细胞活性的机制。

4 低剂量放疗影响基因表达协同免疫治疗

研究人员通过N-亚硝基二乙胺（N-nitroso diethylamine，NDEA）诱发小鼠肝细胞肝癌，结果发现不管与未经任何治疗的小鼠相比，还是与经低剂量放疗或康普瑞汀磷酸二钠（combretastatin A-4 disodium phosphate，CA-4DP）单独治疗的小鼠相比，低剂量放疗和CA-4DP联合治疗在所有时间段均显著抑制Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1（Rho associated coiled-coil containing protein kinase 1，ROCK1）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的基因表达[50]。VEGF通过增加调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）和肿瘤相关巨噬细胞和（或）单核细胞的数量并增强其抑制功能来创造促肿瘤微环境[51-52]，从而在肿瘤血管生成、肿瘤转移以及免疫抑制方面发挥作用。因此，低剂量放疗这种抑制VEGF基因表达的效果也能增强免疫系统的功能。同样的，低剂量放疗还能上调活化T细胞的典型基因、编码T细胞趋化因子基因、抗原呈递相关基因的表达[20]，这可能也是低剂量放疗促进T细胞浸润的机制之一。

5 低剂量放疗阻断免疫抑制关键途径

5.1 细胞毒性 T淋巴细胞相关蛋白 4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA 4）

CTLA4主要表达于活化的CD4+、CD8+T细胞，也表达于Treg细胞表面，并在Treg的免疫抑制功能中发挥不可或缺的作用[53]。CTLA4与B7分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。低剂量放疗能上调T细胞上CD28的表达并下调CTLA4的表达[54]，同时抑制IL-10的产生，同样也能下调Treg细胞表面CTLA4的表达[55]，从而导致免疫增强。

5.2 Treg

Treg抑制自身和非自身抗原的异常/过度免疫反应，以维持免疫稳态。在肿瘤免疫中，Treg细胞通过抑制抗肿瘤免疫参与肿瘤的发生发展。低剂量放疗显著降低Treg的数量和比例[56]，并降低Treg细胞表面CTLA4的表达[55]，从而减少Treg细胞对肿瘤免疫的抑制作用。

6 低剂量放疗增强抗程序性死亡受体 1（programmed cell death 1，PDCD 1，也称PD- 1）或抗程序性死亡受体配体 1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD 1LG 1，也称PD-L 1）单克隆抗体的免疫作用

PD-1通过结合T细胞表面PD-L1调节T细胞的活性，诱导抗原特异性T细胞的凋亡并抑制Treg的凋亡，在促进肿瘤免疫逃逸方面发挥着至关重要的作用。低剂量放疗能增强T细胞的浸润[21]，也能通过增强DC的活性加强肿瘤抗原呈递[29-30]，而在此时联合抗PD-1或抗PD-L1单克隆抗体治疗可减少特异性T细胞的凋亡，进一步加强T淋巴细胞的抗肿瘤效果，从而改善局部肿瘤控制、长期生存，预防肿瘤复发[57]。

7 小结与展望

放疗联合免疫治疗给肿瘤治疗带来了新的希望，放疗和免疫治疗的结合具有局部抗肿瘤和全身抗肿瘤效应的潜力。有研究证明，低剂量放疗比中高剂量放疗对正常组织的危害更小，继发性肿瘤的发生风险也更低。但目前的问题是：①低剂量放疗联合免疫治疗可以通过多种错综复杂的机制促进机体的抗肿瘤效果，但各种机制之间的相互影响尚未明确，同时低剂量放疗联合免疫治疗用于临床的安全性还需要进一步验证。②低剂量放疗除了通过免疫系统发挥抗肿瘤作用外，通过其他机制（抑制肿瘤转移、诱导肿瘤细胞凋亡、改善肿瘤细胞的乏氧状态等）也能很好地发挥抗肿瘤效果，如何更好地联合其他治疗发挥更佳的效果也是需要关注的问题。③低剂量放疗联合免疫治疗理论上能发挥很好的抗肿瘤效果，但目前尚未大规模应用于临床，还需更多临床证据证明低剂量放疗联合免疫治疗的理论优势，为患者带来生存获益。