丝素蛋白复合水凝胶于肿瘤治疗的研究进展

2022-11-27郑法康龚海东纪文阳李金库李禄荣

丝绸 2022年10期

郑法康, 龚海东, 王闯, 纪文阳, 李金库, 李禄荣

(1.牡丹江医学院附属红旗医院神经外科,黑龙江牡丹江 157000; 2.高州市人民医院神经外科,广东高州 525200)

肿瘤的发病率逐年上升,严重威胁着人类的健康,自1845年系统地报道了第一例恶性肿瘤病例开始,到最近几十年,人们才逐渐对癌症相关的生物学和病理学有了深入的研究[1-2]。2021年美国预计新发癌症病例将达1 898 160例[3]。丝素蛋白(Silk fibroin,SF)是美国食品药品监督管理局批准的天然高分子材料,由于在生物医学工程方面表现出杰出的优点,使其受到科研人员的广泛关注[4]。在探索肿瘤治疗方法的过程中,局部化疗已被归为恶性肿瘤的常规治疗方法[5-6]。SF水凝胶结合化疗药物在肿瘤局部化疗方面具有重要意义,它能够在相对较长的时间内保持肿瘤原位的高药物浓度,同时具有药物载体、药物缓释及非手术输送药物等优点[7]。本文简要介绍了SF水凝胶的特点,包括SF水凝胶的性质、肿瘤相关应用和前景,并探讨了近年来SF水凝胶载药在抗肿瘤方面的研究进展,以期拓宽SF水凝胶的应用范围。

1 SF及SF水凝胶的性质

SF是家蚕蚕丝经脱胶得到的天然结构性蛋白(图1)[8],由多肽重链(350 kDa),多肽轻链(25 kDa)和糖蛋白P25组成,具有α-螺旋和无规卷曲的二级结构,呈水溶性,且生物相容性、稳定性较高[9]。由于SF有丰富的β-折叠结构,可在体内通过酶降解和非酶降解,这保证其杰出的机械性能和生物降解性,使这种天然蛋白质已成为实验模型及生物纳米技术可调设计的良好药物载体[10-11]。水凝胶具有高分子电解质特性和三维聚合物网络,它能够在保持其结构完整性的同时吸收大量水分,SF水凝胶是可以模拟生物软组织性质的一类先进材料形式[12]。SF水凝胶具有无毒性、非免疫原性、药物缓释特性及局部可注射性,且可作为药物载体持续释放药物[13-15]。Lovett M L等[16]使用SF水凝胶作为载体,在体外和体内注射SF水凝胶负载贝伐单抗制剂,释放曲线显示可持续释放3个月以上,并且在3个月后具有生物降解的迹象。由于其药代动力学和生物降解特性,该给药系统可减少药物的给药频率。

2 SF复合水凝胶成胶方式

水凝胶能够模拟组织细胞外间质组成,在组织工程应用中被大量用作人工基质。SF水凝胶通过与某种物质交联后,再通过物理或化学方法促进其形成SF复合水凝胶,得到的SF复合水凝胶较单纯的SF水凝胶因复合物不同,使得其在某方面性能更具有优势,这表明SF水凝胶具有杰出的可利用性和可塑性。研究发现,丝素溶液的凝胶化基本是由β-折叠转变引起的,除电场诱导的SF水凝胶是转变为α-螺旋外,与丝素溶液相比SF凝胶中的β-折叠或α-螺旋含量更高,增加β-折叠或α-螺旋含量可加快凝胶速度[17-18]。SF可经过物理或化学方法诱导其凝胶化,物理方法主要是温度、剪切力、超声波、电场,其中温度及剪切力是从分子层面加速凝胶,分别是增加分子之间的碰撞和促进分子间相互作用,而超声波则是通过局部区域极端压力和温度导致凝胶化和聚集,同样在SF溶液中施加电场会导致局部pH值降低,进而导致丝素蛋白聚集凝胶化[19-21]。

化学诱导凝胶化相对物理诱导可供选择的方案较多,主要包括表面活性剂、小型中性添加剂、酸碱度、化学交联、化学偶联、聚合物试剂、有机试剂(醇类等)、盐类、高压一氧化碳,其中使用表面活性剂进行化学诱导可以产生机械性能良好、稳定的SF水凝胶[22];使用小型中性添加剂(如甘油等)诱导SF水凝胶,可减少SF水凝胶的凝胶化时间,目前已应用在生物医学方面[23];通过实验证明酸碱度的调定对SF溶液凝胶化有直接影响,特别是pH值在3.8～3.9处时,可加速形成稳定的SF水凝胶,这是由于在靠近其等电点的pH值可以诱导蛋白质沉淀[24];化学交联剂(如过氧化氢和辣根过氧化物酶等)可用于共价交联上酪氨酸残基的酚基而形成高弹性SF水凝胶[25],同样化学偶联也是在酪氨酸残基上进行修饰,从而调节疏水和亲水性质,这种方法能够在短短的5 min至2 h内快速产生受控的SF水凝胶[26]。因此SF水凝胶可以通过不同的凝胶方式,来加强某一特殊的性能,也常常与多种材料复合,被加工成特性不同的药物载体,使其从组织工程到生物医学甚至神经传感上都得到广泛的应用。

3 SF水凝胶在肿瘤方面的应用

3.1 对于肿瘤体外模型方面的应用

SF水凝胶易于被修饰,因为其有从水溶液或有机溶剂中加工成多种材料形式的能力,使其成为当下研究的热点之一。Ribeiro V P等[18]用辣根过氧化物酶交联反应形成SF水凝胶,其构象由无规则卷曲变化为β-折叠,将胶质母细胞瘤包封在SF水凝胶中进行实验。该研究利用快速反应的SF水凝胶作为三维体外肿瘤模型,为研究肿瘤细胞程序性死亡的微环境提供了有力的工具。Carvalho M R等[27]用辣根过氧化物酶交联SF溶液形成3D体外动态模型模拟体外类瘤环境,并用直肠癌细胞证明此3D模型能够精确地可视化观察癌细胞迁移,且可通过改变模型微环境,观察癌细胞的行为改变。Kundu B等[28]用SF和结冷胶通过调节适合的比例形成水凝胶,模拟骨肉瘤体外模型,并通过实验验证脂肪来源干细胞对骨肉瘤细胞三维球状体模型的作用。体外3D模型的建立是体外癌细胞系培养和体内肿瘤之间的中间模型,对于医学发展具有重要意义。

3.2 SF水凝胶在各肿瘤方面的应用

SF水凝胶是一种很有开发潜能的材料。近年来,SF水凝胶以其优异的生物相容性、可控制的体内降解性和可调节的力学性能在药物输送中的应用受到了广泛关注。通过物理或化学处理方式及与其他生物材料复合制备出不同功能的载药SF水凝胶,在各系统肿瘤的研究和应用中取得了良好的成果(图2)。

3.2.1 SF水凝胶在胶质母细胞瘤方面的应用

胶质瘤是中枢神经系统中发病率、恶性程度最高的肿瘤,胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)预后极差,其中位生存期约15个月,5年生存率不足10%,原位小范围复发率极高[29-31]。其治疗主要以手术治疗为主,放化疗为辅,但由于血脑屏障化疗效果较差,而局部原位治疗不但可以克服血脑屏障,而且能提高药物利用率、降低药物副作用对人体的伤害。SF水凝胶其惰性和无免疫原性、易于装载多种治疗剂和释药可控性等特点,成为一种潜在的药物输送的优质生物材料。有实验将SF水凝胶植入小鼠尾状核,通过电生理等实验证明脑组织对SF水凝胶有良好的生物相容性及耐受力。术中或超早期的术后局部原位治疗,可填补GBM术后放化疗标准治疗策略中1个月的伤口愈合空白期,增加肿瘤治疗的连续性。Yao Q等[32]研究中将SF水凝胶与胆绿素联合形成双功能水凝胶,通过注射到裸鼠的皮下胶质瘤肿瘤模型中表明,SF水凝胶不但能响应近红外照射在肿瘤局部产热,防止光吸收剂的泄漏损害邻近组织,同时还发挥抗炎作用,刺激血管生成和伤口愈合。高级别胶质瘤术后病人中,大多数具有神经功能障碍,目前修复中枢神经系统的有效疗法尚不存在。Gisbert Roca F等[33]将透明质酸(Hyaluronic acid,HA)和SF结合,发现结合SF可以改善HA的力学和生物学性能,可以成为有效的生物相容性神经导管。虽然目前还没有明确其可否用于肿瘤术后神经纤维束的修复,但基于干细胞的神经纤维顺上修复疗法已被广泛应用于脑损伤的动物模型,一些临床实验也证实了其有效性[34-36]。综上,SF水凝胶具有药物载体和保护修复脑组织的性能,在局部原位化疗方面有重要的地位,是优异的媒介,SF水凝胶作为局部原位治疗的药物载体已经成为一个重要的趋势,且对于术后复发、肿瘤部位较深,越过或达到对侧胼胝体胶质母细胞肿瘤治疗有重要意义。

3.2.2 SF水凝胶在乳腺癌方面的应用

乳腺癌是2020年女性癌症特异性死亡的主要原因之一。目前在乳腺癌的研究中,虽然有大量的实验通过预测和评估预后的标记物来决定是否支持化学治疗[37-38],但当下化疗仍然是预后不良患者的主要治疗措施之一[39],寻找新的治疗策略是非常急迫的。Laomeephol C等[40]用二肉豆蔻酰甘油磷酸甘油(Dimyristoyl glycerol phosphate glycerol,DMPG)为基础的脂质体包封抗癌药物姜黄素,并且通过DMPG的疏水区和SF链相互作用快速凝胶化,形成载药复合体,用乳腺癌细胞进行体外评价脂质体-姜黄素-SF复合水凝胶的抗肿瘤能力,实验证明水凝胶中缓慢释放的姜黄素可以持续抑制细胞生长。三阴性乳腺癌具有复发率高、侵袭力强、转移能力强等特点,已被临床公认为最需要治愈的恶性乳腺癌类型[41-42]。Wang H等[43]利用聚多巴胺交联胶原/丝素复合水凝胶,凝血酶通过互补寡核苷酸被装载到水凝胶中,形成了一种具有光响应性的可注射水凝胶。在近红外光存在的情况下,水凝胶可以吸收近红外光并将其转化为热,不仅可以触发凝血酶的释放,将锁定的凝血酶被释放到邻近组织的血管中,以促进血液凝固,还可以减少促进血管生成的信号分子的分泌,减少血管内皮细胞生长因子的分泌,从而阻止邻近组织的血管生成。体内外实验结果表明,通过阻断肿瘤周围血管、阻止血管生成,这种营养剥夺策略能有效地预防三阴性乳腺癌复发和转移。Gou S Q等[44]开发出一种负载阿霉素和荧光素Cy7的SF水凝胶,展示出了集合化疗、光热、光动力疗法为一体的SF复合水凝胶,在体内小鼠乳腺癌模型实验中展示出强大的抗肿瘤效果。因此,这种可注射水凝胶具有很大的潜力,可以作为一种天然的多反应药物释放系统,用于协同治疗肿瘤。SF通过各种修饰负载药物形成一种可注射水凝胶,以微创的给药途径在局部有限的空间内给药,且具有触变性和凝胶形成特性,是一种很有前途的局部治疗肿瘤的策略。

3.2.3 SF水凝胶在肝癌方面的应用

肝癌的发病率逐年上升,是癌症相关死亡的主要原因之一[45-46]。Cao H等[47]将丝素蛋白和羟丙基纤维素两种天然聚合物合成水凝胶,同时装载亲水性药物阿霉素和疏水性药物姜黄素,利用姜黄素与水凝胶中β-折叠区域的相互特异性作用,极大地提高了疏水姜黄素的溶解度和稳定性,使其展现出更好生物利用度。装载双药的水凝胶较游离药物和阿霉素单一载药水凝胶在肝癌小鼠模型上显示出更好的长期持续抗肿瘤效果,装载双药水凝胶具有较好的治疗效果和逆转多药耐药的作用。Wu P Y等[48]用SF水凝胶装载SF纳米粒子包封的盐霉素和紫杉醇,可同时杀死肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞,在小鼠皮下肝癌肿瘤模型中较单一给药与传统给药方式相比表现出明显的抑制肿瘤生长作用。这种纳米颗粒复合水凝胶可以连续缓释药物达30 d以上,作为抗肿瘤药物释放平台无疑对于防止肿瘤复发和转移十分有利。Qian K Y等[49]开发了一种以SF和氧化铁纳米立方体离子(Iron oxide nanocubes,IONCs)为基础合成的可注射亚铁磁性丝素水凝胶,应用在兔肝癌的治疗,其治疗效果与光热治疗相比,嵌入式IONCs赋予亚铁磁性与远程高热SF水凝胶之间存在一个交变磁场,导致深部肿瘤的有效磁高热性能增强。此外,由于SF水凝胶中离子的限制,与直接给予单分散磁性纳米粒子相比,可以避免对正常组织的热损伤。这些结果表明,亚铁磁性丝素水凝胶可以通过超声引导的介入性磁热治疗在更深的位置治疗肿瘤。保玉[50]制备了丝素蛋白和明胶的水凝胶,并用京尼平交联明胶提升水凝胶的力学性装载青蒿素进行动物实验,结果表明,15 d内载药复合水凝胶能够显著抑制肿瘤的生长,且对裸鼠的正常生长没有毒副作用。SF水凝胶载药是实体肿瘤手术切除后局部应用于腔内的潜在给药系统,有望成为一种新的、强大的局部抗肿瘤治疗的方案。

3.2.4 SF水凝胶在胃癌方面的应用

藤黄酸(Gambogic acid,GA)对胃癌有抑制作用,但藤黄酸具有溶解度差、非特异性生物分布、有毒性、半衰期短等缺点,在实际应用中受到了极大限制。Zhang D H等[51]研发了一种由羟丙基纤维素、SF和甘油组成的可注射水热敏凝胶,实验采用此水凝胶包封藤黄酸纳米颗粒和肿瘤穿透肽,用甘油调节水凝胶的凝胶时间和微孔大小,使其具备良好的兼容性和持续释放特性,水凝胶构建的肿瘤穿透肽和藤黄酸纳米颗粒具有显著的抗肿瘤作用,其作用与保留药效、局部给药和持续释放肿瘤穿透肽促进纳米颗粒渗透到肿瘤的深部有关。Gangrade A等[52]用SF水凝胶和抗癌药顺铂纳米颗粒复合注射丝素水凝胶,在体外胃癌模型中展现出了明显的抗癌效果,且SF复合水凝胶呈剪切变稀特性,黏度随着剪切应变的增加而降低,由于其具有剪切稀释性,丝素水凝胶可以很容易地注射到疾病部位,在那里它可以作为药物持续释放的储存库,展现出了优异的可注射性。局部给药方法是为了防止肿瘤的复发,并抑制其扩散到附近的健康组织,这是目前正在实施的全身静脉给药方法的一种替代方法,其中需要一个仓库来局部限制药物在病变部位的位置,以防止癌症复发并抑制其扩散到附近的健康组织。

3.2.5 SF水凝胶在骨肿瘤方面的应用

骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨癌[53]。如今,骨肉瘤的治疗包括手术和化疗方案,但有约30%的患者对化疗有耐药性,最终肿瘤发生转移,使得患者预后并没有得到明显改善[54]。水凝胶有优异的机械性能能够模拟组织的细胞外基质成分,广泛应用于组织工程。Yu Q W等[55]将SF和透明质酸甲基丙烯酸酯化形成水凝胶,装载壳聚糖纳米颗粒包封的姜黄素,用于骨肉瘤治疗和促进骨组织再生,并且用乙醇增加水凝胶中β-折叠的含量,以增加复合水凝胶的机械性能,且在pH值小于6时姜黄素表面的可电离氨基被质子化,使壳聚糖成为阳离子聚电解质。随后,由于聚合物链的排斥,壳聚糖开始膨胀,使姜黄素的释放速度加快,表现出pH值响应性释放姜黄素,使其在血液中更安全(pH值7.4),在肿瘤部位(pH值4～6)更有效地释放。此外,装载姜黄素的复合水凝胶在体外能明显促进小鼠胚胎成骨细胞的增殖。Pierantoni L等[56]报道了以过氧化钙为底物用辣根过氧化物酶交联SF水凝胶,结果表明,含钙SF水凝胶可作新的原位疗法用于骨癌治疗,尤其是在骨肉瘤治疗方面展现出极大的潜力。总之,SF水凝胶展示出了优越的物理性质、易于修饰的同时,自身结构稳定的性质及强大的膨胀比有利于水凝胶与组织的黏附等多重功能。

3.2.6 SF水凝胶在其他肿瘤方面的影响

SF水凝胶本身具有良好的生物稳定性,与其他化学物质结合依然能够保持稳定性,并且可以接受物质对其的修饰,展现出SF水凝胶广泛的可行性。Yan L P等[57]报道了一种酶交联SF水凝胶体系,用SF水凝胶包裹小鼠胚胎肿瘤细胞,并且进一步将海拉细胞掺入SF水凝胶中,通过体内鸡绒毛膜尿囊膜肿瘤形成模型对构建的结构进行研究。实验证明,在体内SF水凝胶可以抑制血管生成和肿瘤形成,并且蛋白质二级结构的转变对其抑制肿瘤生长也有重要意义。WU C Y等[58]构建了一种杂化酶基SF水凝胶系统,用SF水凝胶负载葡萄糖氧化酶,使葡萄糖氧化酶逐渐从SF水凝胶释放到肿瘤微环境中以介导葡萄糖的消耗,导致葡萄糖饥饿诱导的癌细胞死亡,为抗肿瘤循环系统中的重要组成部分,这些水凝胶为癌症研究和生物材料的应用提供了新的见解。

4 现状与展望

SF水凝胶无毒,可在体内降解,在一定范围内水凝胶的储能模数高于损耗模数,证明水凝胶有良好的热稳定性,目前越来越多的实验将其作为药物缓释载体。因方法、条件、诱导试剂不同对SF水凝胶复合物成凝胶时间长短不同,形成的复合水凝胶的性能也不同,对于各种诱导成凝胶的方法和试剂的选择上还有待进一步研究(表1)。目前研究发现,在SF成凝胶过程中,其蛋白质二级结构无规卷曲变化到β-折叠,β-折叠的含量越高其支撑力学越强,且不同物质的修饰可以形成不同的药物释放特性(如pH值响应释放、多重药物释放等)。当下的研究表明,SF水凝胶是一种良好的药物缓释载体,在局部给药方面非常有前景。SF水凝胶具有可塑性、抗炎、伤口愈合等作用,因为桑蚕来源的SF没有细胞黏附基序,导致SF水凝胶上培养的细胞显示出低附着和递增值,但其有良好的细胞相容,适合于填补空隙和清除肿瘤切除后残留的肿瘤细胞。部分研究证实,装载相应肿瘤敏感化疗药的水凝胶不仅可以发挥局部小范围化疗防复发的作用,还能激活免疫系统,达到全身抗肿瘤转移的效果,这是未来对于肿瘤术后辅助治疗的研究方向;随着再生医学的迅速发展,对受控给药和细胞给药的研究深入,合适的药物缓释载体是增加局部药物浓度、减少副作用、降低耐药的捷径,SF复合水凝胶虽然可以通过添加物质改善SF水凝胶的孔径、疏水性、机械性能等,但如何控制负载药物前期的突释仍然是人们探索的一个方向;目前研究还停留在动物肿瘤模型上验证抗肿瘤的效果,且原位模型较少、给药操作相对简单,忽略了局部肿瘤微环境对复合水凝胶的影响,以及模型的稳定性、三维体外肿瘤模型较实体肿瘤细胞外基质的离子交换、pH值等因素,细胞外微环境的相似程度还有待进一步研究,未来的研究发展中还需进一步模拟肿瘤全面的周围内环境和对此类凝胶制剂在体内的药动学进行其机理的探索。