食用菌的分子生物技术研究分析

□ 傅婧洁

（海南师范大学，海南 海口 571158）

作为一项全球化产业，食用菌具有巨大的经济价值，现代分子生物学技术的发展更是为食用菌发展提供了必要的支持。分子生物技术作为一门研究分析生物生命结构的技术门类，不仅促进了生物医学研究的发展，更为食用菌的分析与应用提供了技术保障。国外学者Devries在1972年最早分离除了裂褶菌，自此，分子生物学技术被广泛应用于食用菌领域。传统食用菌多采用的是自然选育、杂交育种，无法满足人们对食用菌产量及质量的需求。分子生物技术的应用机制建立在生物科学之上，其主要通过蛋白质、核酸在分子水平上的研究分析，帮助研究者充分掌握住被研究目标的生物性质、分子构成。尤其是近年来我国食用菌产业的快速发展，分子生物技术中的DNA分子标记、分子转化、基因克隆三种技术方法被人们广泛关注。通过DNA分子标记、分子转化、基因克隆三种分子生物技术在食用菌中的研究应用，能够为食用菌的高效育种、繁殖、生产等开拓出更广阔的的前景。文章以DNA分子标记、分子转化、基因克隆三种技术方法为例，提出分子生物技术在食用菌研究中的使用途径与机制，从而彰显出分子生物技术在食用菌研究中的价值作用。

一、分子生物技术的相关概述

分子生物技术是分子生物学范畴下的主要实验方法之一。而分子生物学（molecularbiology）是生物学中的一个重要的分支，是研究细胞不同系统中生物分子之间生物活性的分子基础，如DNA、RNA、蛋白质之间的相互作用与生物合成。分子生物学是生物学中的一个大门类，分子生物学下又涵盖了多种分子生物学技术，如常见的分子克隆技术、聚合酶链式反应技术、凝胶电泳技术、高分子印记和探针技术等等。分子生物技术是在分子水平上通过对蛋白质和核酸的研究，获得研究对象的性质，并利用其性质在分子结构水平上进行操作，实现人们对生物学的改造的一种技术方式。分子生物学技术的理论基础来源于PCR（序列互补）和酶切（识别酶切特定序列），主要的分子生物技术有已知序列的基因合成、未知序列的全基因的合成、southern杂交、northern杂交等技术。分子生物技术主要用于重组蛋白的生产、基因改造物种、基因治疗、基因改造及刑事案件的断定、环境保护等等。

二、食用菌研究应用中常用的分子生物技术类型

（一）DNA分子标记

DNA分子标记是分子生物技术中的主要技术种类之一，其主要研究生命物的分子构成与DNA组成序列。从DNA分子标记的基本机制上分析，分子标记的概念本身可以分为广义、狭义两种说法。其中，广义上的分子标记主要是指可遗传和可检测的DNA序列或蛋白质。而狭义上的分子标记是主要是指能够反映单个生物或种群基因组某些差异的特定DNA片段。DNA分子标记的应用形式与标准体现为：限制性片段长度的多态性；分子检测表现的共显性；数目可变串联重复多态性等等。其中，RAPD、RFLP、SCAR、AFLP等分子标记技术被广泛应用于食用菌的检测、实验、研究之中，通过对食用菌中的分子组成及化学物质提取，有效探测到生物体中的DNA序列。

（二）分子转化

分子转化作为分子生物技术的主要手段之一，其在食用菌研究中的使用，关键在于对食用菌的化学物质元素的转换与构建，通过相应的化学技术手段及生物提取物，对食用菌中的化学物质进行提取与检测，从而获取研究所需的标志物，将检测出的标志物以相应的检测技术进行重复检测分析，从而得到生物体的化学检测结果，为食用菌的培育、种植、生产及食用、药用等提供化学物质基础。目前，随着我国对食用菌的广泛研究与种植，分子转化已经成为食用菌研究、培育、化学物质检测等重要的技术手段之一，成为了基因工程、微生物遗传、分子遗传等研究领域的基本实验技术。食用菌的分子生物学研究之中，分子转化往往分为启动子、筛选标记、PEG法、电激发、限制性内切酶介导整合法等技术种类。

（三）基因克隆

基因克隆是20世纪70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，其技术内容上可分为五大要素，即分、切、连、转、选。其主要目的是对生物体中的基因制取与无性繁殖，即将生物体中的器官、细胞、组织等以人工合成的方式提取出基因，然后克隆或拼接到另一个生物体目标上，从而实现生物体复制的目的。基因克隆的本质目的是通过基因的复制进行无性繁殖，从而将一个生命体的优秀基因复制或转移到另一个生命体上，实现优秀延伸拓展的目的。野生菌界本身有不少的菌类能够进行自主的无性繁殖，他们先天具备了克隆能力。而以食用菌为例，采用基因克隆技术将野生菌中的化学物质提取出来，然后与其它菌类进行基因重组，从而实现食用菌基因性质上的互补，可更好地提高食用菌的产量、育种效果、经济价值。

三、各类分子生物技术在食用菌研究中的应用方法

（一）DNA分子标记：科学选取菌种样品，分子标记结合鉴定

DNA分子标记能够对物种个体差异性予以反映，具有遗传性，能够对DNA序列及蛋白质予以监测。目前，在食用菌中常用的DNA分子标记技术主要包括RAPD技术、SCAR、RFLP技术，目前DNA在食用菌中的应用技术已经趋于成熟，关于食用菌遗传多样性、杂交子鉴定及菌株鉴别方面的报道较多。DNA分子标记技术在食用菌研究中的使用，无论是对食用菌DNA的水平遗传变异性质研究，还是对食用菌的种群鉴定及优良品种选育都具有十分重要的意义。例如：以银耳的菌属分子鉴定，在鉴定的过程中，需要应用到DNA分子标记技术方式的应用。首先，可采用常规PCR的分子标记技术，将银耳的基因寡核苷酸点样放置在芯片表面，确保实验材料的完整、有效。然后，对菌种样品进行处理，确保处理后的样品还能够满足检测的实际需求。其次，对经过处理后的菌种进行核算扩增，并对菌种样品的核算进行有效提取，然后借助荧光素做好相应的标记。并将芯片上的寡核苷酸点样与处理好的菌种样品进行杂交，再通过分析样品荧光分析模式和扫描仪定量，实现对菌种分子性质的化学分析。同时，目前随着DNA条形码鉴定技术的发展，也可采用该模式进行银耳的DNA特征提取与分析，如采用RFLP分子标记技术，对银耳的化学物质元素进行标记鉴定，由于该技术方式可广泛适用于种内与种间遗传变异的鉴定，因此，其本身具备了标记覆盖性强、检测结果稳定的优点。目前在食用菌核酸研究领域常用方法为荧光定量PCR、Southern等，主要被用于食用菌的质量评价与监督、生产质量控制。近年来新发现的ncRNA，其属于具有特定功能的RNA小分子，具备转录功能，但对食用菌无编码。通过DNA分子标记技术的使用，帮助研究者有效明确食用菌的化学物质构建及其规律，为食用菌的化学提取与种根培育提供技术基础。

（二）分子转化：注重菌根化学物质提取，分子转化结合物理鉴定

分子转化技术是分子生物学中的重要技术方式之一，其目的就是将外源的DNA分子引入受体细胞之上，并通过化学检验与化学物质转换的方式使生物体获取新的遗传性状的一种技术方式。分子生物技术在块菌中的研究应用，主要是方便研究者更深一步探究出块菌的化学物质组成及特性，从而全面掌握到块菌的繁殖与生长机制，为块菌的培育、种植提供资料支撑。例如以块菌为例，块菌也称松露，是一种食用价值极高的食用菌类，素来有“黑色金刚石”之称。首先，分子生物技术在块菌中的使用，尤为注重块菌的化学物质分子的转化，为了最大程度上确保分子生物技术分析的有效性及研究结果客观性，研究者可以选取我国雷公山自然保护区的块菌，该地区的块菌常年生长在野生环境中，能够最大程度保证块菌的化学物质稳定、原始、纯粹。其次，对块菌的化学物质组成鉴定及其分子构成的研究中，可使用PCR扩增的方式进行，即将保存于CTAB缓冲液中的块菌菌根挑取2～3个根尖，然后采用CTAB法提取根尖中的DNA。其中，PCR技术即聚合酶链式反应技术，PCR技术主要是通过运用变性以及复性的原理，在特定的引物的引导下，使得DNA序列在规定时间内进行大量的复制，所形成的DNA序列会在短时内进行快速、大量的扩增。然后，再使用其它检测技术与方法就可以及时得到食用菌化学物质组检测结果。最后，研究者在保证实验环境符合标准的情况下，将提取出的总DNA以ITSIF、ITS4为引物进行PCR。进行PCR后得到凝胶电泳检测标志物，将标志物以系统发育分析的技术方法进行检验分析，从而得到块菌的化学分子构成规律及菌类分类地位。电激法是分子转化常用方法，其利用高压脉冲作用，将外源DNA摄入原生质体膜，经过一系列改良操作能够在带壁细胞组织打孔，其所需的DNA含量少，但仪器昂贵，且电击操作会对转化子造成一定的损伤。

（三）基因克隆：菌类细胞化学性质分析，功能基因结合分子特征

在基因转移、基因编辑技术支持下，食用菌的蛋白质、脂肪及淀粉等营养要素含量、性质的改变成为可能，可帮助食用菌向有益于人们身体健康的方面发展。基因克隆技术方式在食用菌的使用，不仅可以用以食用菌的功能基因定位，还可以用以食用菌的化学物质提取及其复制。通过基因克隆技术在食用菌中的应用，能够对携带突变基因的等位基因菌株特性进行鉴定，有利于对食用菌品种的培育，从而复制培育出更优质的菌种。例如以猴头菌为例，猴头菌俗称猴头菇、刺猬菌等，是一种药食功能兼具的食用菌类，在我国的河北、吉林、四川、辽宁等地广泛种植。生物科学界对猴头菌的功能基因定位及食用菌的基因克隆培育研究中，通常使用到基因克隆的技术手段。首先，对猴头菌进行生物化学实验之前，明确猴头菌的基本性状、特征、基因特点，如猴头菌的菌丝生长速度、酶活性及产量等等，采用分子生物化学技术的方式了解猴头菌菌丝生长特征、酶活性、分子细胞等基础构成特点基础上，采用基因克隆技术的手段，对猴头菌中的DNA序列及化学物质细胞进行提取，从而初步获取到猴头菌的基因分子。其次，采用构建遗传连锁谱的方法，寻找猴头菌中的与分子检测目标相似的及数量相对的状位点紧密连锁分析，对生物体的分子及化学物质进行标记而提取，从而方便用于其它菌类的合成上。最后，采用基因克隆的技术手段，对猴头菌木质素降解酶基因全长cDNA的分子序列和蛋白结构进行预测，采用实验标准中所需的分子生物技术对猴头菌锰过氧化物酶（MnPs）基因进行转换与复制，研究乙醇脱氢酶启动子alcA基因对重组表达菌株细胞活性的调控机制，从而实现猴头菌基因功能的精准定位与优质分子化学物质的提取复制，并且为筛选重组MnPs高效表达量的工程菌株提供理论基础。

四、结语

综上所述，分子生物学技术作为生物科学界的主要实验技术手段，是研究者充分分析与了解生物体基本构造与化学物质组成、生命体构成的主要技术渠道。尤其是分子生物学范畴下的DNA分子标记、分子转化、基因克隆三种技术方法，其被广泛应用于我国食用菌的研究之中，为食用菌的菌种培育、种植及生产等提供了主要的科学技术手段，促进食用菌的高效生产。基于DNA分子标记、分子转化、基因克隆三种技术方法的应用，我国生物科学界对其研究较为广泛，因此，结合着我国对DNA分子标记、分子转化、基因克隆三种技术方法的研究理论，以各类食用菌为例，更进一步梳理出DNA分子标记、分子转化、基因克隆三种技术方法的使用方式，从而促进分子生物技术在食用菌中的研究应用。