miR-128、ZEB1对子宫内膜癌细胞迁移侵袭和上皮间质转化的影响及其靶向关系验证

李品，蔡智慧，李晶晶，王琰，陈静，杜晓欣，王兰，闫丽伟

1 河北大学附属医院妇科，河北 保定 071000；2 河北大学附属医院麻醉科

子宫内膜癌（EC）是一种常见的妇科恶性肿瘤，约占女性癌症的4.8%，并且发病率和病死率均有上升趋势［1］。侵袭或转移是EC恶性发展的主要原因之一，尽管早期阶段的EC患者的5年生存率可高达82%，但对于复发或晚期EC患者，5年生存率仍低于30%［2］。对于晚期EC患者采用手术切除、化疗和放疗等传统治疗策略效果较差，并且化疗和放疗通常会对健康组织和器官造成有害影响［3］。因此，了解EC内在的分子机制对于寻找新的靶向治疗方法、改善EC患者的治疗效果和预后具有重要意义。

miRNA是一类小的非编码RNA，在转录后水平调节基因表达，参与人类疾病发展的一系列生物学过程，尤其是肿瘤的发生发展［4］。miR-128是近年发现的miRNA家族成员之一，研究发现，其在人类多种恶性肿瘤中表达异常，与肿瘤细胞的侵袭转移等恶性表型密切相关［5］。目前有关miR-128在EC中的研究甚少，并且其对EC细胞迁移和侵袭的影响尚不清楚。锌指E盒结合同源框1（ZEB1）是近年来研究较多的与恶性肿瘤细胞侵袭转移密切相关的转录调节因子［6］。研究［7］发现，ZEB1在EC中表达异常升高，并且沉默ZEB1能够显著降低EC细胞侵袭和转移能力［8-9］。目前研究［10-11］发现，miR-128能够调控ZEB1参与机体细胞重要的生命活动，但miR-128是否通过调控ZEB1影响EC细胞的侵袭转移尚不清楚。2021年8月—2022年4月，本研究观察了EC细胞系中miR-128和ZEB1的表达变化，并进一步探讨了miR-128对Ishikawa细胞的迁移、侵袭及上皮间质转化的影响以及其与ZEB1的靶向调控关系，探讨miR-128与ZEB1在EC侵袭转移中可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂、仪器人子宫内膜上皮细胞hEEC及人EC细胞系HEC-1A、Ishikawa、KLE均购自中国科学院上海细胞库，均置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃、5% CO2的培养箱中培养。待细胞融合度达80%时，应用0.25%胰酶消化进行传代培养。RPMI-1640培养基、胎牛血清均购自美国Hyclone公司；miRNA抽取试剂、Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒和qRT-PCR荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；荧光素酶报告基因质粒ZEB1-WT和ZEB1-MUT、miR-128模拟物（miR-128 mimics）、miRNA阴性对照（miRNA-NC）及PCR引物均购自上海吉玛制药公司；Transwell小室购自美国Corning公司；基质胶购自美国BD公司；E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、ZEB1及GAPDH抗体均购自美国Abcam公司；荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；PCR仪、光学显微镜、电泳仪购自美国Bio-Rad公司；CO2细胞培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司；超净工作台购自上海力新仪器有限公司。

1.2 HEC-1A、Ishikawa、KLE及hEEC中miR-128的检测采用qRT-PCR法。应用miRNA抽取试剂提取细胞总RNA，按照反转录试剂盒说明书操作合成cDNA，以cDNA为模板，加入PCR引物，按照qRTPCR试剂盒说明书操作配制PCR反应体系进行PCR反应。PCR反应参数：95℃、2 min；95℃、15 s，60℃、15 s共40个循环。miR-128上游序列：5′-CGCCGATATTGGTCGGATGAT-3′，下游序列：5′-TTC AGCGTACACCTAATCGGTATG-3′；U6上游序列：5′-CCGTCGTAGGCAGCCTCTACGCT-3′，下游序列：5′-GCATCCAACGTACGCTCATCGT-3′。以U6作为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-128基因相对表达量。由于miR-128在Ishikawa细胞系中的表达水平最低，因此本研究选择Ishikawa细胞系作为后续过表达miR-128转染实验的细胞系，这样过表达miR-128效果更加明显。

1.3 细胞分组及miR-128转染将Ishikawa细胞分为miR-128过表达组和阴性对照组。转染操作时，取对数增殖期的Ishikawa细胞，以1×105个/孔的细胞密度接种于6孔细胞板，按照Lipofectamine2000试剂盒说明书进行转染操作，分别转染miR-128 mimics和miRNA-NC至Ishikawa细胞，转染后继续置入37℃、5% CO2的恒温环境中继续培养，12 h后更换新鲜培养基，48 h后收集细胞进行后续实验。

1.4 Ishikawa细胞侵袭能力的观察采用Transwell侵袭实验。首先取出Mgtrigel胶与无血清培养基混合，均匀铺于Transwell小室上室底膜上室面。取转染后48 h各组Ishikawa细胞，无血清细胞培养基重悬，调整细胞密度至3×105个/mL。取200 μL细胞悬液接种至小室上室，下室注入500 μL含10%胎牛血清的细胞培养基，将小室于37℃、5% CO2的恒温条件下，继续培养48 h，轻轻拭去小室上室面未穿膜的细胞，多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染色30 min，高倍光学显微镜随机选择5个不重复的视野计数拍照并计数穿膜的细胞数目。

1.5 Ishikawa细胞迁移能力的观察采用细胞划痕实验和Transwell迁移实验。①细胞划痕实验：收集转染后48 h各组Ishikawa细胞，制备细胞密度1×106个/mL的细胞悬液，均匀接种于6孔细胞板各孔中，充分混匀，置入37℃、5% CO2的恒温箱中培养，细胞融合度至100%时，应用20 μL移液枪头垂直6孔板底部划出一字划痕，PBS冲洗后，加入无血清细胞培养基继续培养，分别于0和48 h时刻用光学显微镜拍照，Image J软件计算划痕愈合率。②Transwell迁移实验：Transwell迁移实验时不对小室底膜上室面进行Mgtrigel胶预铺，余实验步骤同Transwell侵袭实验。

1.6 Ishikawa细 胞 中E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、ZEB1蛋白的检测采用Western blotting法。收集各组细胞，应用RIPA细胞裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度。每泳道取同等量总蛋白样品上样，进行SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜上，洗膜后，将PVDF膜置于5 %的脱脂牛奶封2 h，洗涤后将PVDF膜置入一抗E-cadherin（1∶1 000）、Fibronectin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、ZEB1（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）溶液中4℃孵育过夜，次日置于二抗溶液中孵育1 h，ECL显影，Image J软件分析条带灰度值。

1.7 miR-128靶向结合ZEB1 3′UTR区的验证采用双荧光素酶报告基因实验。取对数增殖期的Ishikawa细胞，接种于6孔细胞板中，应用Lipofectamine2000转染试剂，分别将野生型ZEB1荧光素酶报告基因质粒ZEB1-WT、突变型ZEB1荧光素酶报告基因质粒ZEB1-MUT与miR-128 mimics或miRNA-NC共转染至Ishikawa细胞，分别为miR-128 mimics+ZEB1-WT组、miRNA-NC+ZEB1-WT组、miR-128 mimics+ZEB1-MUT组、miRNA-NC+ZEB1-MUT组。转染24 h后，收集细胞，应用荧光素酶检测试剂盒检测细胞的相对荧光素酶活性。

1.8 统计学方法采用SPSS21.0统计软件。正态分布检验采用Shapiro-wilk法检验，符合正态分布的计量资料采用±s表示，两组比较采用独立样本t检验，多组间计量资料比较采用单因素方差分析，进一步组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EC细胞系及子宫内膜上皮细胞系hEEC中miR-128、ZEB1蛋白相对表达量比较EC细胞系HEC-1A、Ishikawa、KLE及 子 宫 内 膜 上 皮 细 胞系hEEC中miR-128的相对表达量分别为0.43±0.12、0.28±0.09、0.48±0.11、1.02±0.04。与hEEC相比，HEC-1A、Ishikawa、KLE细胞中miR-128的相对表达量均降低（t=8.08、13.01、7.99，P均＜0.05）。Western blotting结果显示，EC细胞系HEC-1A、Ishikawa、KLE及 子 宫 内 膜 上 皮 细 胞系hEEC中ZEB1蛋白的相对表达量分别为0.91±0.14、1.14±0.18、1.06±0.19、0.21±0.11。与hEEC相比，HEC-1A、Ishikawa、KLE细胞中ZEB1蛋白的相对表达量均升高（t分别为6.81、7.64、6.71，P均＜0.05）。

2.2 过表达miR-128对Ishikawa细胞迁移、侵袭的影响qRT-PCR结果显示，阴性对照组和miR-128过表达组Ishikawa中miR-128相对表达量分别为0.98±0.04、3.41±0.23。两组比较，t=18.03，P＜0.05，提示转染效率较高。细胞划痕实验结果，阴性对照组和miR-128过表达组Ishikawa细胞划痕愈合率分别为（65.5±7.3）%、（25.2±4.1）%，两组比较，t=8.34，P＜0.05。Transwell迁移实验结果，阴性对照组和miR-128过表达组Ishikawa细胞迁移穿膜数量分别为（421±44）、（172±31）个，两组比较，t=8.01，P＜0.05。Transwell侵袭实验结果，阴性对照组和miR-128过表达组Ishikawa细胞侵袭穿膜数量分别为（414±49）、（229±40）个，两组比较，t=5.07，P＜0.05。

2.3 过表达miR-128对Ishikawa细胞E-cadherin、Fibronectin、Vimentin、ZEB1蛋白表达的影响miR-128过表达组Ishikawa细胞中E-cadherin蛋白相对表达量高于阴性对照组（t=5.55，P＜0.05），Vimen-tin、Fibronectin、ZEB1蛋白相对表达量低于阴性对照 组（t分别为5.38、5.32、12.55，P＜0.05）。见表1。

表1 两组细胞中上皮间质转化相关蛋白及ZEB1的相对表达量比较（±s）

注：与阴性对照组比较，*P＜0.05。

组别miR-128过表达组阴性对照组E-cadherin 1.12±0.16*0.46±0.13 Fibronectin 0.56±0.14*1.26±0.18 Vimentin 0.43±0.10*0.99±0.15 ZEB1 0.19±0.07*0.96±0.08

2.4 miR-128与ZEB1的靶向关系双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-128 mimics+ZEB1-WT组、miRNA-NC+ZEB1-WT组、miR-128 mimics+ZEB1-MUT组、miRNA-NC+ZEB1-MUT组Ishikawa细胞的相对荧光素酶活性分别为0.40±0.11、0.98±0.06、0.97±0.04、1.03±0.06。与miRNANC+ZEB1-WT组相比，miR-128 mimics+ZEB1-WT组Ishikawa细胞的相对荧光素酶活性明显降低（t=8.02，P＜0.05）；而与miRNA-NC+ZEB1-MUT组相 比，miR-128 mimics+ZEB1-MUT组Ishikawa细胞的相对荧光素酶活性无明显变化（t=1.44，P＞0.05）。

3 讨论

EC是女性癌症患者死亡的重要原因。近年来，EC的发病率和病死率一直居高不下，晚期EC患者通常有较高的复发率和不良预后，治疗效果不能令人满意［12-13］。至今EC发生发展的分子生物学机制尚不清楚，因此探索EC的发病机制，寻找新的诊断和治疗EC的靶向基因具有重要意义。

近年研究［14］发现，miRNA可以通过对下游关键基因mRNA翻译的抑制或者降低mRNA的稳定性从而影响下游分子通路的活性，起着重要的调控作用。将miRNA作为肿瘤分子治疗的靶点，恢复细胞的正常分子表型，从而起到抑制肿瘤细胞生长和转移的作用，是目前肿瘤研究的热点问题。SHIGETA等［15］发现，miR-152低表达与EC患者的不良预后密切相关，过表达miR-152能够抑制EC细胞的增殖及侵 袭 迁 移。miR-29a-3p［16］、miR-543［17］、miR-379-5p［18］等miRNA也被相继证实作为EC的抑制因子发挥作用。目前EC细胞中已经发现了许多差异表达的miRNA，这表明它们可能在EC发生发展中起着重要的作用［19］。但至今尚未发现在EC发生发展中起着最关键作用的miRNA。miR-128是一种在脑神经系统高表达的miRNA，既往研究主要集中在其与神经系统疾病的关系，近期研究发现其与恶性肿瘤细胞的分子表型也密切相关［5］。在结直肠癌［19］、骨肿瘤［20］、口腔鳞癌［21］等恶性肿瘤中均发现miR-128作为抑癌因子发挥作用。本研究通过qRT-PCR发现EC细胞系HEC-1A、Ishikawa、KLE中miR-128表达均明显降低，提示miR-128在EC发生发展中可能也起着抑癌因子的作用。由于miR-128在Ishikawa细胞系中的表达水平最低，因此本研究选择Ishikawa细胞系作为后续过表达miR-128转染实验的细胞系。进一步本研究通过脂质体转染的方法，转染miR-128模拟物至Ishikawa细胞过表达miR-128，细胞划痕实验和Transwell实验显示过表达miR-128的Ishikawa细胞划痕愈合率、迁移和侵袭穿膜细胞数目均明显下降，提示过表达miR-128能够明显抑制EC细胞的迁移及侵袭能力。上皮间质转化是上皮细胞表型由上皮向间质转换的生物学过程，肿瘤细胞通过上皮间质转化获得间质细胞特性，失去黏附能力和紧密连接从而获得侵袭转移能力，因此上皮间质转化是肿瘤细胞侵袭和转移的关键步骤。本研究发现过表达miR-128的EC细胞中间质源性标志物Fibronectin、Vimentin蛋白的表达水平明显降低，而上皮源性标志物E-cadherin蛋白表达显著升高，提示过表达miR-128能够明显抑制EC细胞的上皮间质转化。

ZEB1是ZEB同源盒转录因子家族的重要成员之一，其定位于人第10号染色体上，在胚胎发育中起着重要调节作用。近年研究［6］发现，ZEB1在恶性肿瘤细胞上皮间质转化的过程中也发挥着调控作用，其表达异常与恶性肿瘤细胞的侵袭转移能力有关。FENG等［22］在研究中发现，ZEB1在EC组织中表达升高，并且与肿瘤分级、肌层浸润和淋巴结转移显著相关。XIAO等［8］研究证实，ZEB1能够调控上皮间质转化影响EC细胞的侵袭迁移能力。近期研究［10］发现miR-128能够调控ZEB1参与食管癌细胞的侵袭转移。miR-128还能够靶向ZEB1调节前列腺癌细胞的化疗敏感性和侵袭性［11］。本研究发现，过表达miR-128的EC细胞中ZEB1蛋白的表达水平明显降低，并且双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-128能够与ZEB1的3′UTR区靶向结合。以上提示miR-128影响EC细胞的迁移、侵袭及上皮间质转化等恶性表型，可能是通过靶向调控ZEB1实现的。

综上所述，miR-128可以抑制Ishikawa细胞的迁移、侵袭及上皮间质转化，ZEB1可促进Ishikawa细胞的迁移、侵袭及上皮间质转化，miR-128与ZEB1具有靶向调控关系。但由于条件限制，本研究没有对miR-128与ZEB1在EC组织中的表达及临床病理特征关系进行研究，有待将来的实验中在组织学层面对miR-128、ZEB1在EC发生进展中的作用进行深入探讨。