色谱质谱联用技术在T2DM发生发展、中医证候相关生物标志物及中药代谢通路识别中的应用进展

李娜芬，陈学勤

1 福建中医药大学附属厦门中医院内分泌科，福建 厦门 361001；2 福建中医药大学第一临床医学院；3 厦门大学附属第一医院中医科

2型糖尿病（T2DM）是一种代谢紊乱的慢性高血糖疾病，其特征在于糖类、脂质和蛋白质代谢的改变。据国际糖尿病联合会IDF最新发布的全球糖尿病地图（第10版）显示：目前有5.37亿成年糖尿病患者，其中有2.4亿为未诊断的糖尿病（44.7%），绝大多数为T2DM。在我国T2DM占糖尿病人群的90%以上［1］。除了极高的发病率和漏诊率，T2DM还会导致多种并发症，如糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变及糖尿病周围神经病变等［2-5］，已经成为严重威胁人民健康的公共卫生问题。在T2DM的发生发展过程中，患者体内往往出现一系列复杂的代谢变化，以往对于T2DM的研究方法主要以系统生物学和生物化学为主，忽视了患者体内整体代谢水平的变化。代谢组学技术可以对生物体内所有的内源性小分子（MW＜1 000 Da）代谢产物进行定性和定量分析，将代谢产物的动态变化与生理病理相关联［6］，目前已广泛应用于心血管疾病、肾病、肿瘤等领域的研究［7-9］。常用的代谢组学技术包括：液相色谱-质谱（LC-MS）、高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）、气相色谱-质谱（GC-MS）、核磁共振氢谱（IH-NMR）。不同的代谢组学技术特点各异，因此要根据不同的实验目的选择相宜的技术。IH-NMR技术可以检测含有碳、氮或氧的化合物，具有前处理简便性、无损伤性、无偏向性等优势，但其灵敏度低、检测动态范围窄、检测的化合物数量有限。质谱技术具有较高的专属性及灵敏度，可以同时快速检测和分析多种化合物，有效地解析样本中的化合物成分；色谱技术具有超高的分离能力，配合质谱的高灵敏度及强特异性的特点，色谱质谱联用技术在代谢组学研究中被广泛应用［10］。近年，色谱质谱联用技术在T2DM的相关性研究中被广泛应用，且取得不少研究成果，现就色谱质谱联用技术在T2DM发生发展早期、不同中医证候生物标志物及中药代谢通路识别中的应用进展进行以下综述。

1 色谱质谱联用技术在T2DM发生发展相关生物标志物识别中的应用

T2DM是一个慢性发展的过程，从临床症状的出现到生化指标的异常，再到相关并发症的发生，往往涉及多种代谢紊乱。通过色谱质谱联用技术可以了解患者体内代谢物的异常特征，识别T2DM发生发展过程中的潜在生物标志物，有利于进一步认识T2DM的生理病理机制。既为临床诊断提供新途径，也利于指导临床及早介入干预手段、控制疾病发展。

1.1 色谱质谱联用技术对T2DM发生相关生物标志物的识别T2DM的发生涉及糖类、脂质、氨基酸等代谢途径的紊乱。当患者出现临床症状或生化指标出现异常时，糖尿病可能已经存在很长时间了，故寻找反映其发生变化的潜在生物标志物可以作为本病的早期诊断指标。LONG等［11］采用超高效液相色谱—高分辨质谱（UPLC-HRMS）技术对空腹血糖受损患者的血清进行代谢组学研究，发现了23种有差异的代谢产物，其中2-乙酰乳酸、2-羟基-2，4-戊二酸盐、l-谷氨酰胺和l-阿拉伯糖水平与空腹血糖受损具有显著的相关性。肖继等［12］基于HPLC-MS的代谢组学方法分析糖耐量异常患者的血清代谢产物，发现甘氨酸、赖氨酸和反式肉桂酸水平相对于健康人均呈下降趋势，可能是T2DM前期的潜在生物标志物。宁萌等［13］采用HPLC-MS技术对初发T2DM大鼠模型的血清样本进行代谢组学研究，发现乳酸、尿素、甘油、L-异亮氨酸、L-丝氨酸等含量显著上升，而氨基丙酸、β-羟基丁酸、磷酸、苏氨酸、甘油酸等含量降低，并随着病情发展而产生明显变化，可作为T2DM早期诊断的潜在生物标志物。PORCU等［14］基于人群列队的纵向数据和2样本孟德尔随机化（MR）的研究揭示了缬氨酸、亮氨酸、肉碱、谷氨酸、丙氨酸、甜菜碱、赖氨酸、甘露等代谢产物的反向因果效应，表明T2DM的遗传易感性可能触发这些代谢产物的早期变化，可作为T2DM早期研究的微代谢指标。谷艳等［15］采用GC-MS技术对T2DM患者的血清代谢物谱进行分析，发现葡萄糖、半乳糖、甘油、游离脂肪酸（FFA C16：0、FFA C18：1、FFA C18：2）、缬氨酸及其代谢物2-酮戊二酸、亮氨酸、异亮氨酸及其代谢物2-酮异己酸浓度显著升高，而甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和天冬酰胺的浓度显著降低。一项基于LC-MS技术的病例对照研究［16］通过对泰国T2DM患者的氨基酸谱进行分离、鉴定和评估，证实了血浆谷氨酸浓度与T2DM的发生独立相关。

以上研究表明，从糖尿病前期到T2DM的发生，通过色谱质谱联用技术均可检测多种有差异的生物标志物，这些有差异的生物标志物可以预测人们患T2DM的风险趋势，为临床早期诊断提供新途径。此外，全方位的代谢谱分析还可以指导临床对无症状的个体进行早期干预手段的介入，实现早发现、早诊断、早治疗。

1.2 色谱质谱联用技术对T2DM并发症发生相关生物标志物的识别T2DM后期可引起的一系列慢性并发症，正是这些慢性并发症导致T2DM致残率及病死率增加。由于早期临床症状不明显，很难对其进行早期干预。目前多依赖于患者自觉定期体检筛查，但具有很高的漏诊率。“既病防变”，寻找可以预测T2DM发展的生物标志物，早期干预，对于控制疾病发展具有重大意义。

TAN等［17］采用LC-MS技术对糖尿病肾病患者的血浆进行代谢组学研究，发现谷氨酰胺、苯乙酰谷氨酰胺、3-氨氧基硫酸、乙酰苯丙氨酸、黄嘌呤、二甲基尿酸和不对称二甲基精氨酸等代谢产物水平明显增加。SHAO等［18］则基于气相色谱仪结合飞行时间质谱（GC-TOFMS）代谢组学方法分析糖尿病肾病患者的尿液，发现了9种有差异的代谢产物，主要涉及12种代谢途径，其中4-羟基苯甲酸、腺苷、1-阿拉伯糖、1-天冬氨酸及加拉基酸可作为糖尿病肾病的潜在生物标志物。朱晓蓉等［19］基于LC-MS代谢组学方法分析增殖期糖尿病视网膜病变患者的血清，发现137种有差异的代谢产物，主要涉及硫代谢、鞘脂代谢、半胱氨酸以及蛋氨酸代谢通路。SUN等［20］采用超高性能液体-Q-Exactive-质谱（UPLC-QE-MS）技术分析糖尿病视网膜病变患者的血浆，发现了22种属于不同代谢途径的代谢产物，认为假尿苷、谷氨酸盐、亮氨酰、亮氨酸和N-乙酰色氨酸可能是糖尿病视网膜病变的特异性生物标志物。任繁栋等［21］采用超高效液相色谱—高分辨质谱（UPLC-HRMS）技术对T2DM合并冠心病患者的血浆进行代谢组学研究，发现了37种有差异的代谢产物，认为脂肪酸代谢在T2DM合并冠心病患者的代谢紊乱中起重要作用。

近年研究［22-25］表明，在DM进展过程中也会影响脑代谢，最终导致糖尿病中枢神经系统的相关代谢紊乱。糖尿病脑病是指糖尿病引起的认知障碍和大脑的神经生理及结构改变，特别是阿尔茨海默病（AD）和抑郁症［26-28］。CHEN等［29］基于LC-MS代谢组学方法分析糖尿病伴轻度认知障碍大鼠模型的血清，发现了94种差异表达的内源性代谢产物，主要参与鞘脂代谢、色氨酸代谢、甘油磷脂代谢，认为血清中的PE、PC、L-色氨酸和1-磷酸鞘氨醇可作为糖尿病伴轻度认知障碍早期诊断的关键生物标志物。SONG等［30］采用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q/TOF-MS）技术分析糖尿病认知功能障碍前期小鼠模型的尿液，认为C8H9N、5-羟基-l-色氨酸、烟酰胺、惰性乙醛、鞘氨酸、焦谷氨酸和n-乳酰缬氨酸可作为糖尿病认知功能障碍的早期生物标志物。一项对来自巴尔的摩衰老纵向研究和尸检队列的脑组织样本进行定量和靶向代谢组学的研究发现，鞘脂代谢的紊乱与尸检时AD病理学的严重程度及前驱期和临床前阶段的AD进展相关，认为鞘脂类可能是AD早期的潜在生物标志物，纠正鞘脂代谢紊乱可作为AD新的治疗策略。

由上，我们可以看到无论是糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变还是糖尿病脑病等，通过色谱质谱联用技术均可以识别与之相关的潜在生物标志物。由于T2DM的预后取决于其并发症的发展，故控制并发症的发展在T2DM的诊疗中至关重要。但临床上大多关注患者血糖情况，往往忽略T2DM后期引起的一系列慢性并发症。通过色谱质谱联用技术可以鉴定T2DM并发症发展过程中的潜在生物标志物，这些生物标志物不仅可以辅助疾病进行分级诊断，还可以指导临床进行早期干预、控制疾病发生，从而降低致残率及病死率。

2 色谱质谱联用技术在T2DM不同中医证候生物标志物及T2DM相关中药代谢通路识别中的应用

中医学作为现代医学的重要组成部分，在T2DM的治疗中具有举足轻重的地位。因证立法、随法选方、据方施药是中医临床诊疗的环节，缺一不可。虽然蕴含着丰富而宝贵的临床经验，但在中医理论方面存在着主观性、模糊性及不确定性等方面的不足。因此，需要利用现代技术建立客观的评价标准，使中医理论更加客观、更加科学。色谱质谱联用技术可以鉴定不同中医证候的潜在生物标志物，识别中药代谢通路，从而为中医现代化研究提供有力工具。

2.1 色谱质谱联用技术对T2DM不同中医证候生物标志物的识别中医以辨证论治为核心，准确化、规范化的辨证不仅是论治的前提，还是提高临床疗效的关键。“证”是疾病过程中某一阶段或某一类型的病理概括，“证候”是病理状态的宏观表现，对中医证候分类的客观化研究有利于进一步认识中医证的本质。代谢组学的整体性和动态性符合中医的“整体观”和“辨证法”的特征，近年来在中医证候分类研究中也取得了不少成果。

杨宇峰等［31］采用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱技术对T2DM脾气虚证大鼠模型的血清进行代谢组学研究，发现2-羟基丁酸、赤藓糖、L-丝氨酸、苯丙氨酸、尿苷二磷酸、L-高丝氨酸等代谢产物水平显著上调，这些物质与体内糖类、脂类、蛋白质等代谢紊乱息息相关。孙思怡采用LC-MS技术分析T2DM上热下寒证患者的血浆，发现了37种有差异的代谢产物，主要涉及11个代谢途径，认为乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱可作为T2DM上热下寒证的特异性生物标志物。YANG等［32］对T2DM血瘀证大鼠模型的血浆进行超高效液相色谱四级杆飞行时间串联质谱代谢组学研究，发现了46种有差异的代谢产物，主要与脂质代谢、半乳糖代谢、亚油酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、糖酵解和花生四烯酸代谢等代谢途径相关。汪晓娟采用LC-MS技术对2型糖尿病肾病Ⅲ期气阴两虚证患者的血清进行代谢组学研究，鉴定出17种有差异的代谢产物，主要以脂代谢紊乱为主，其中磷脂酰甘油、鞘磷脂和溶血磷脂酰乙醇胺可作为2型糖尿病肾病Ⅲ期气阴两虚证的潜在生物标志物。

中医讲究四诊合参，通过“望、闻、问、切”收集患者临床资料，从而进行辨证论治、遣方用药。然而中医证候分类在实际应用中主要依赖医生的主观判断，缺乏客观证据支持，而对中医证候分类的不合理或不正确的判断可能导致处方不正确，直接影响临床治疗。通过色谱质谱联用技术可以识别出不同中医证型的潜在生物标志物，这些生物标志物可以为中医证候分类提供客观化、科学化的参数指标，从而指导中医临证，提高临床疗效。

2.2 色谱质谱联用技术对T2DM相关中药代谢通路的识别色谱质谱联用技术不仅为中医证候分类的客观化需求提供了理论上和技术上的可能，也为下一步通过中药干预代谢机制研究奠定基础。时正媛等［33］采用超高效液相色谱—串联四极杆飞行时间质谱技术发现金芪降糖片（黄芪、黄连、金银花组成的中药复方制剂）可以使溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）（18∶0）和LysoPC（16∶1）等9种代谢物下调，LysoPC（18∶1）和LysoPC（20∶0）等6种代谢物上调，可能通过调节脂代谢紊乱而缓解T2DM的进程。周元等［34］发现，黄芩对T2DM大鼠粪便中的三羟基三甲基吲哚酮、白三烯、亮氨酰脯氨酸和雌二醇等含量具有调节作用，主要干预鞘脂类代谢和脂肪酸代谢。周子妍等［35］发现葛根芩连汤可以通过调节胆汁酸代谢、磷脂代谢以及肠道菌群代谢从而降低T2DM胰岛素抵抗大鼠模型的胰岛素抵抗指数，同时预防血糖升高。孙丽丽等［36］对给予当归补血汤干预的T2DM小鼠模型的血清进行代谢组学研究，发现了16种潜在的生物标志物，涉及7个主要的代谢途径，从而推测当归补血汤可能通过提高机体对胰岛素敏感性、调节糖脂代谢紊乱、减轻炎症反应等缓解T2DM的进程。以上研究表明，运用色谱质谱联用技术可识别药物代谢通路、监测药物作用途径，使得药物在人体的作用机制更加可视化、微观化，这对于实现临床精准用药具有重要意义。

综上所述，色谱质谱联用技术在T2DM发生发展过程中已经识别了大量的潜在生物标志物，这使得对T2DM的生理病理机制认识更加系统化、微观化。色谱质谱联用技术识别不同中医证候分类生物标志物，使得中医辨证论治更加客观化、科学化，从方法论的层面为中医辨证论治的应用提供了理论依据。此外，色谱质谱联用技术在中药代谢通路识别中的应用，既为临床精准用药提供了可能，也为未来挖掘具有降糖作用的中药或中成药提供有力工具。但目前的研究仍存在一些不足：T2DM是一个动态发展的异常变化过程，目前的研究多从静态角度切入研究，忽略疾病过程中代谢标志物的整体动态变化。未来若能着眼于动态角度的研究，对T2DM的生理病理机制将会有更加深入的认识；在T2DM及相关并发症方面已取得一些研究成果，但对糖尿病前期的研究尚少，论据不足，未来可针对糖尿病前期开展相关性研究，“未病先防”也是临床工作的重要着眼点；目前只针对个别中医证型进行代谢组研究，若能深入开展中医证候的系统生物学研究，完善中医辨证论治体系的证候学基础，不失为中医现代化研究的新突破口。