microRNA在心搏骤停后脑损伤中的研究进展

王静综述 谢吐秀，吕菁君审校

microRNA(miRNA)作为一种小的非编码RNA分子，含18～22个核苷酸，在转录后水平通过抑制翻译和/或降解编码目标蛋白的mRNA来调控基因表达[1]。在大脑中，miRNA在神经细胞的分化、胚胎的神经系统发育、树突和突触可塑性中发挥重要作用[2]。有研究表明，心搏骤停(cardiac arrest，CA)期间，大脑缺血缺氧会导致缺血性脑损伤，其外周循环中存在的脑源性miRNA水平反映了血脑屏障受损和神经细胞死亡的程度[3]。近年来的研究发现，miRNA在CA后脑损伤的发生、发展中起着至关重要的作用，可能成为预测和治疗CA后脑损伤的潜在靶点。因此，亟需进一步探索miRNA在CA后脑损伤中的病理生理特点及分子机制。本文拟从miRNA概述、CA后脑损伤概述和miRNA在CA后脑损伤中的作用及机制三方面进行综述，旨在为CA后脑损伤的预测和治疗提供理论基础。

1 microRNA概述

生物体内RNA种类繁多，功能复杂。一般根据其能否编码蛋白质分为编码RNA和非编码RNA，前者主要是指mRNA,后者则包括rRNA、tRNA、miRNA等。在miRNA家族中，其生物发生存在差异，但均会经历从细胞核进入细胞质，最终都会形成功能性核糖核蛋白复合物，又称为RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。在细胞核中，初级miRNA (pri-miRNA)以染色体DNA为转录模板，由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ催化转录，然后被RNase Ⅲ Drosha和DGCR8切割成双链发夹状前体miRNA (pre-miRNA)。随后，pre-miRNA经 Exportin5/RanGTP复合物穿梭到细胞质中，由RNase Ⅲ Dicer进一步加工形成成熟的 miRNA双链体[5]。成熟的miRNA与Argonaute家族蛋白结合，形成RISC，并与靶标 mRNA 的 5' UTR 相互作用，在转录后水平通过抑制翻译或切割mRNA来调控基因表达[5]。成熟的细胞外miRNA可被包装到外泌体、微粒、脂囊泡中，并与Argonaute-2、nucleophosmin-1蛋白、高密度或低密度脂蛋白结合，分泌到血液循环中以保护其不被核糖核酸酶降解[6]。近年来的研究发现，一种miRNA可同时与多个靶基因的mRNA结合发生联合作用,参与各种病理生理过程，如胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、脂肪代谢、细胞分化等[3]。 目前常采用高通量miRNA芯片技术来研究miRNA和疾病的关系、诊断疾病，甚至将miRNA作为疾病治疗靶点以研发新药物或材料。

2 CA后脑损伤概述

CA作为全球的一种临床急症，具有极高的致死率和致残率，可导致广泛的脑损伤和认知障碍。由于神经元主要依赖于有氧呼吸，因此，在CA自主循环停止期间大脑更易出现不可逆性损害，从而导致死亡、昏迷、持续植物人状态，以及许多其他神经功能障碍。有研究表明，CA后脑血流立即停止可引起大脑原发性损伤，在再灌注后的数小时和数天可出现更为严重的继发性脑损伤和神经细胞死亡[7]。虽然CA后脑损伤的机制尚不完全清楚，但神经炎性反应已被广泛认为起着重要作用，表现为神经胶质细胞的激活、外周免疫和炎性细胞的涌入及促炎介质的释放，包括细胞因子和黏附分子[8]。小胶质细胞作为大脑中的先天免疫细胞，可能会被过度激活，并在这些炎性级联反应中发挥主动作用。除此之外，细胞焦亡(pyroptosis)、细胞凋亡、自噬、坏死性凋亡、氧化应激和内质网应激等亦被认为与CA后脑损伤的发生发展密切相关[9-14]。可见，CA后脑损伤的病理机制是错综复杂的。近年来的研究发现，尽管心肺脑复苏指南一直处于不断更新和完善中，但CA后脑损伤患者的预后仍然不容乐观。寻找新的CA后脑损伤预测指标和进一步探明其相关的分子机制，以更好地治疗CA后脑损伤患者迫在眉睫。

3 miRNA在CA后脑损伤中的作用及机制

3.1 miRNA可作为CA后脑损伤的生物标志物 目前CA后的神经功能评估一般是在成功复苏后至少72 h，但仍有许多因素会混淆CA后的神经预后评估，包括治疗性低温、使用镇静剂、神经肌肉阻滞剂及全身缺血引起的代谢紊乱[3]。NSE作为脑损伤后释放到血液中的一种蛋白质，一直以来被当作CA后的预后标志物，但其本身具有一定的局限性，如敏感度低、容易增加假阳性结果[15]。近年来的研究发现，在病理情况下，miRNA可较蛋白质更早地释放，且其表达水平可使用定量PCR、微阵列和高通量测序等轻松检测，在预测神经功能方面具有高特异度和敏感度等优点[16]。神经功能预后差的院外CA患者血清miR-122和miR-2显著上调，而miR-191-5p呈显著下调，可作为CA后脑损伤的预测因子[17-18]。Stefanizzi等[19]的研究结果亦证实，CA后患者循环中的脑源性miR-9-3p、miR-124-3p、miR-129-5p的水平与NSE水平、6个月时的神经功能和存活率显著相关。此外，循环中的miR-574-5p水平与女性CA后的神经功能结果显著相关[20]。最近的一项研究发现，前脑缺血后3 h时，miR-100-5p和miR-125b-5p的表达在海马CA1区呈显著上调；在再灌注24 h后，miR-15b-5p、miR-16-5p、miR-181a-5p、miR-219a-2-3p、miR-23b-3p和miR-338-3p在齿状回(dentate gyrus，DG)中显著上调；在再灌注72 h时，miR-219a-2-3p在DG中显著上调，而miR-329-3p在CA1区显著上调[21]。可见，miRNA有望成为预测和治疗CA后脑损伤的生物标志物。然而，目前尚不清楚CA后释放到循环中的大脑特异性miRNA的动力学，以及何时测定miRNA可准确预测神经功能预后。此外，不同样本来源的miRNA水平与神经功能预后及病死率的关系需待进一步探讨。

3.2 miRNA在CA后脑损伤中的调控机制 miRNA在调控CA后脑损伤过程中起着十分重要的作用，尤其是在CA后的神经炎性反应和神经元死亡方面。近年来研究发现，miRNA参与调控CA后脑损伤的具体机制错综复杂，目前主要涉及的是神经炎性反应、氧化应激和细胞凋亡，且其相互之间存在串扰。

3.2.1 miRNA在CA后脑损伤中调控炎性反应：越来越多的研究表明，炎性反应是CA诱导的短暂性全身缺血后神经功能缺陷的主要致病因素[22]。并且，CA后脑损伤的各个阶段均与炎性反应有关，通常可通过增加炎性因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的释放，启动下游的中枢促炎细胞因子信号通路来加重神经损伤[23]。近年来的研究表明，miRNA在CA后脑损伤所致的炎性反应中发挥着重要的作用[22, 24]。Sun等[24]研究表明，CA后大鼠海马回的miR-155显著上调，可显著增强IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，而抑制海马回miR-155的表达，可显著降低上述炎性因子的水平。其可能机制为miR-155-5p是通过靶向DUSP14，激活NF-κB和MAPKs信号通路来引发神经元炎性反应，继而加重脑I/R损伤的[25]。此外，在脑I/R损伤过程中，miR-124-5p可直接与CYBB 3'-UTR结合并负性调节CYBB和NOX2的表达，且miR-124的过表达可通过负性调控NOX2显著抑制NF-κB信号激活和TNF-α、IL-6的产生[26]。

小胶质细胞作为中枢神经系统先天免疫反应的第一线，在CA后几分钟即被激活[27]。有研究表明，CA后脑损伤的初始炎性反应是小胶质细胞的激活，并且脑损伤的早期，小胶质细胞具有抗炎作用(M2表型)，而在脑损伤晚期，具有促炎作用的小胶质细胞(M1表型)会分泌炎性因子，如TNF-α、Toll样受体4、基质金属蛋白酶9等，来增加血脑屏障的通透性[9]。目前，小胶质细胞活化相关机制已成为脑I/R损伤的研究热点。有研究发现，在大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)诱导的脑缺血小鼠模型中，皮质、海马和基底节区的miR-424在缺血后8 h时呈显著低表达，且小胶质细胞被激活；而过表达miR-424可通过将小胶质细胞周期阻滞在G1期来抑制小胶质细胞的活化，继而减轻神经炎性反应[28]。Ni等[29]的研究发现，缺血性卒中的患者和动物血浆中miR-7c-5p呈显著低表达，而miR-7c-5p的过表达除了可以抑制炎性因子的释放外，还可通过靶向Caspase3 mRNA的3'-UTR抑制Caspase3的表达来调控小胶质细胞M1和M2型转变，继而抑制神经炎性反应。NF-κB作为产生神经炎性反应的重要因素之一，在脑I/R损伤过程中受到miRNA的调控，继而可加重或减轻脑损伤[30]。此外，miR-210可部分通过靶向SIRT1来诱导小胶质细胞M1型激活，继而阻断NF-κB亚基p65去乙酰化，并激活NF-κB信号通路，而抑制miR-210的表达则可有效抑制小胶质细胞介导的神经炎性反应，显著减轻脑损伤[31]。除此之外，miR-210还可与TET2结合，通过促进NF-κB亚基p65发生乙酰化，增强其与小胶质细胞中IL-1β启动子的DNA结合能力，继而加重神经炎性反应[32]。尽管目前miRNA调控小胶质细胞活化的相关研究主要聚焦于缺血性脑卒中，但可以推测miRNA亦可调控CA后小胶质细胞介导的神经炎性反应[24]。并且，抑制小胶质细胞的过度反应和小胶质细胞介导的神经炎性反应可能是未来用于治疗CA后脑损伤的重要策略之一。

3.2.2 miRNA在CA后脑损伤中调控氧化应激：以活性氧(reactive oxygen species，ROS)过量产生为特征的氧化应激是CA后I/R损伤的主要根源之一[13]。氧化应激在整个CA、心肺复苏(CPR)期间都会出现，尤其是在CA后自主循环恢复(return of spontaneous circulation，ROSC)之后。既往的研究表明，适度的氧化应激可保护机体，而严重且持续的氧化应激会破坏机体的抗氧化防御机制，极易对细胞造成不可逆的损伤，尤其是神经元。核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反应元件作为机体重要的内源性抗氧化信号通路，参与调控内源性抗氧化基因的表达[33]。有研究表明， ROSC后24 h海马回的丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性升高，伴有GSK-3β的磷酸化被抑制，Nrf2易位到细胞核，HO-1的表达下调[10]。在许多I/R损伤过程中，miRNA被证明可通过microRNAs靶向Nrf2的3'-UTR或其上游的调节因子来调节Nrf2的表达和激活[34]，但其在CA后脑损伤中的作用及机制尚不清楚。最近的研究发现，CA后大鼠海马回的miR-155上调可显著增强氧化应激产物8-iso PGF2α和蛋白质氧化标志物8-OHdG的表达，而给予miR-155抑制剂后可通过抑制海马回氧化应激产物和NADPH氧化酶的表达来改善神经严重程度评分和脑水肿[24]。Wang等[35]的长时间(60 min)体外循环大鼠模型研究发现，miR-29c的上调可抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha，PGC-1α)的表达，增加丙二醛的表达，且术后14 d前庭功能和认知功能显著降低；而给予深低温(18℃)处理可通过抑制miR-29c的表达，启动PGC-1α依赖性途径来减轻长时间循环停止所致的神经损伤[35]。可见，CA后脑损伤期间，miRNA表达失常可调控氧化应激介导的神经元死亡，而通过抑制或增强miRNA的表达可提供神经保护作用。

3.2.3 miRNA在CA后脑损伤中调控细胞凋亡：miRNA已经成为脑I/R损伤期间神经元存活的关键调节因子。越来越多的研究表明，细胞凋亡是CA后脑损伤过程中神经元死亡的主要机制之一[36]。有研究发现[12]，CA后ROSC 24 h时，miR-26a显著表达；而miR-26a的过表达可直接靶向GSK-3β的3'-UTR，导致β-catenin信号通路的激活，通过抑制大脑皮质神经干细胞凋亡，增加神经干细胞存活率来改善CA大鼠的神经功能。可见，miR-26a可通过调控神经干细胞凋亡来减轻CA诱导的脑损伤。Gao等[37]通过体外循环60 min大鼠模型发现，miRNA-23a的下调可促进神经元发生细胞凋亡，而给予深低温(18℃)处理可通过显著抑制海马回生长停滞特异性蛋白5的表达来增强miRNA-23a表达，继而降低PTEN和Bcl-2相关X蛋白的表达，以及增加Bcl-2的表达和磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B的比率，神经元凋亡被抑制，神经功能得到了保护。因此，敲低生长停滞特异性蛋白5可通过增强miRNA-23a的表达来抑制神经元凋亡，继而减轻组织学损伤，并增加海马体中存活的神经元数量。此外，Pan等[38]的大鼠CA模型表明，miR-126过表达可显著下调大鼠海马回p38MAPK、JNK和Caspase-3的表达，并上调ERK1/2的表达，通过抑制海马回神经元凋亡来提高大鼠心肺复苏后神经功能评分和改善海马回的病理形态。可见，通过抑制或过表达miRNA可调控CA后神经元凋亡，这为治疗CA后脑损伤开辟了一条潜在的道路。

多数研究表明，炎性反应、氧化应激和细胞凋亡在CA后脑损伤的发生发展均起着举足轻重的作用，它们在调控机制上并非单独发挥作用，可能存在着相互串扰[22]。

4 小 结

综上所述，miRNA种类繁多，在CA后脑损伤中既可发挥保护作用，亦可加重脑损伤，且其调控机制错综复杂。目前已有大量研究表明，miRNA可预测CA后脑损伤的预后，且通过靶向miRNA抑制神经炎性反应、减少神经细胞死亡、促进神经细胞增殖和再生来减轻脑损伤。未来的研究应进一步深入探讨miRNA在CA后脑损伤中的调控作用及机制，得出更多优质的miRNA，与传统生物标志物联合作为CA后脑损伤风险分层，预测CA早期、中期或长期预后和治疗效果的工具。此外，还可以进一步深入探讨在CA后脑损伤过程中，miRNA调控细胞焦亡、铁死亡、坏死性凋亡、内质网应激及钙超载等的具体机制，为更好的精准预测和治疗CA后脑损伤提供理论依据。