转基因技术在抗病虫草甜菜培育中的应用与展望

董刚刚，王颖，韩成贵

（中国农业大学植物保护学院/农业农村部作物有害生物监测与绿色防控重点实验室，北京 100193）

0 引言

甜菜（Beta vulgarisL.）是藜科甜菜属二年生草本植物，是我国第二大糖料作物，近年来已成为我国北方地区的主要经济作物，甜菜产业的高质量发展对于我国食糖有效供应和区域经济的可持续发展具有重要的战略意义[1-3]。我国是世界第三大食糖生产国，同时也是世界第二大食糖消费国[4]。根据国家统计局数据，2018年，我国甜菜种植面积21.6万hm2，产糖131.54万t；2019年全国甜菜种植21.9万hm2，产糖139.28万t[5]。

甜菜病虫草害是影响甜菜产量和品质的重要因素。据报道，目前甜菜害虫种类约300种，病害种类20余种，杂草种类10 科21 种[6-10]。我国甜菜生产中危害严重的主要病害有7种，分别是甜菜褐斑病、白粉病、根腐病、立枯病、黄化病毒病、蛇眼病和丛根病[7-8,11-13]。其中，甜菜丛根病可造成产量损失30%～40%，含糖降低4～9 度[1]；甜菜褐斑病可造成甜菜块根减产10%～20%，含糖率降低1～2 度[1]。内蒙古等地区重迎茬比例偏高，在一定程度上加剧了根腐病和丛根病的发生[14]。甜菜生产中主要害虫有甜菜象、甜菜茎象甲、华北大黑鳃金龟、黑绒金龟、地老虎、小地老虎、草地螟、甘蓝夜蛾、甜菜夜蛾等[6-9]。甜菜田主要杂草有禾本科的狗尾草、野燕麦、稗草等，阔叶类的反枝苋、灰绿藜、刺儿菜、田旋花、龙葵、苦苣菜、三叶草、野油菜等[8]。针对上述有害生物的防控，我国已建立了比较成熟的甜菜病虫草害综合防控技术体系，但依然存在很多的问题，比如田间抗药性的发展导致主要药剂的防治效率降低，杂草防治难度大和抗逆育种技术薄弱等[15-17]。随着现代生物学技术的快速发展，以转基因技术为代表的遗传修饰技术在甜菜抗病虫害、耐除草剂和品质改良等方面凸显了强大的优势[18-19]。

转基因技术发展迅速，已成功商业化应用于大豆、玉米和棉花等作物，但对于转基因甜菜，目前尚处于技术研究阶段，只有耐除草剂转基因甜菜在美国和加拿大等国家得到商业化种植[20]。根据农业转基因生物安全证书（进口）批准清单，截止2020 年，我国只批准了（原）孟山都远东有限公司科沃施种子欧洲股份公司的抗除草剂甜菜H7-1进口生物安全证书。2002年农业部颁发了《农业转基因生物安全评价管理办法》，相关审批制度明确规定：作为加工原料进口的农业转基因生物，不允许在国内种植。本文在已有研究的基础上重点综述了转基因技术和基因编辑技术在甜菜抗病虫和耐除草剂方面的研究进展与应用情况，同时探讨转基因及基因编辑技术在我国甜菜产业中的发展前景。

1 转基因和基因编辑技术的研究进展

1.1 转基因作物发展现状

转基因技术是指利用现代生物学技术手段，挑选可以满足人们某种需求的目标基因，将其人工分离、重组或特异性改造，然后导入并整合到生物体基因组中，从而实现可以明显改善生物原有性状或赋予其新的优良农艺性状的目的[21]。通过目标基因的定向改良，转基因作物（GMO）可以获得许多有益性状，如抗虫、抗病、抗逆、抗（耐）除草剂、改良营养成分及提高作物营养价值等[22]。目前，大豆、玉米、棉花和油菜是全球商业化应用最多的4种转基因作物，抗虫性和耐除草剂是生产中商业化应用最广泛的两大目标性状[23]。

2019 年全球生物技术/转基因作物商业化发展数据表明，2019年是转基因作物商业化种植的第24年，全球共有29 个国家种植转基因作物，种植总面积达1.904 亿hm2，其中发展中国家24 个，转基因作物种植面积占全球总种植面积的56%，发达国家有5 个，占比44%[20]。全球排名前五位的主要种植国分别是美国7 150万hm2、巴西5 280 万hm2、阿根廷2 400 万hm2、加拿大1 250 万hm2和印度1 190 万hm2，总计1.727 亿hm2，占全球种植面积的91%；中国320万hm2，排名第七，批准大规模种植的转基因作物主要为抗虫转基因棉花和抗病毒病转基因番木瓜[20]。此外，全球有42 个国家/地区选择进口了转基因作物，用于食品、饲料加工。2019年，大豆、玉米、棉花和油菜依然是全球商业化应用最多的4 种转基因作物，根据单种作物的种植面积计算，全球74%的大豆、31%的玉米、79%的棉花和27%的油菜是生物技术/转基因作物[20]。转基因作物通过增加作物生产率、保护生物多样性、改善生态环境、减少二氧化碳排放和缓解贫困等方式为全球应对粮食安全、可持续发展和气候变化等问题做出了重大贡献[23]。1996—2018 年，转基因作物为全球创造了2 249 亿美元的经济效益，其中中国获益232亿美元，2018年转基因作物为中国创造了15亿美元的经济收益[20]。

甜菜作为目前被批准进行商业化种植的24种转基因作物之一，2019年全球转基因甜菜种植面积47.3万hm2，其中仅美国就种植45.41万hm2；2019年加拿大转基因甜菜种植面积达到23%的最高增幅[20]。

1.2 基因编辑技术

基因编辑（Gene editing）也称之为基因组编辑或基因组工程，指利用精准的基因序列编辑工具对动植物本身具有的基因序列进行有目的改变，通过基因失活、过表达或功能变化改变动植物表型性状，从而实现对动植物品种有效改良或其他特定目标[24]。常见的基因编辑技术包括锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN），CRISPR/Cas9 基因编辑技术是继前两个技术之后的新一代基因组定点编辑技术，研究人员通过设计不同的sgRNA，引导Cas9 核酸酶特异性地在想要的任何基因位点进行基因编辑[25]。CRISPR/Cas9介导的精准基因编辑技术，例如植物基因组定点编辑、单碱基替换、引导编辑和同源重组体系等，近年来相关技术在农作物基因功能鉴定、研究、开发和精准分子育种中发挥了重要作用，展现了广阔的发展潜力和重大应用价值[26]。CRISPR/Cas9技术因其专一性好、基因定点突变效率高，已经在高产水稻、抗病小麦、耐储藏马铃薯和生产健康油料大豆等作物中成功应用[25-26]。

中国农业科学院作物科学研究所利用CRISPR/Cas9 定点敲除冬小麦品种‘郑麦7698’和春小麦品种‘Bobwhite’中的SBEIIA基因，分别获得了高抗性淀粉的冬、春小麦新种质，相关研究为营养功能型小麦新品种的成功培育提供了新的选择路径[27]。中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组，利用TALEN和CRISPR/Cas9 基因组编辑技术，实行了对小麦MLO基因的定向突变，获得了对白粉病具有广谱抗性的小麦材料；此外，该研究组还利用基因编辑技术，成功在小麦中实现了基因的定点插入，插入之后的片段可以稳定遗传,相关研究为小麦基因功能的研究和培育新品种、新材料的创制提供了全新的技术路线[28]。中国科学院上海植物逆境生物学研究中心，朱健康院士团队利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术，成功编辑了水稻ABA 受体基因PYL，显著提高了水稻产量[29]。此外，基因编辑技术在耐除草剂研究方面成果丰硕，中国农业大学姜临建团队，成功构建了可应用于植物基因组的单碱基编辑技术体系，并利用该体系对拟南芥的ALS基因进行单碱基编辑，创制抗除草剂新品种[30]。

目前，基因编辑技术还没有在甜菜上成功应用的报道。基因编辑技术在甜菜中的研究主要围绕线粒体基因组展开，重点通过RNA 编辑，研究甜菜雄性不育细胞质线粒体（CMS）基因的突变，包括rps3、rps4、rps7和nad4、nad6、nad9、atp6等[31-34]；构建甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）全长侵染性cDNA 克隆，开发了可表达Cas9转基因植株的BNYVV载体，将促进甜菜和相关作物基因组研究和多种蛋白的表达[35]。

CRISPR/Cas9系统目前已经成功应用于丝状真菌的基因组编辑，研究人员将单链核苷酸作为修复模板，在某些曲霉属丝状真菌中诱导点突变[36]。此外，CRISPR/Cas9 可以通过对黑僵菌（Metarhizium anisopliae）基因组的现场突变，有效改变靶基因编码蛋白的功能特性，获得XlnR和GaaR的活性菌株可显著提高甜菜粕中D-半乳糖醛酸的释放[36]。

2 抗病转基因甜菜的研究

抗病转基因甜菜的研究，主要根据甜菜生产中可造成重大损失的几种主要病害展开，如甜菜丛根病、甜菜根腐病、甜菜立枯病、甜菜褐斑病和甜菜孢囊线虫病[37-38]。

1978 年，发根农杆菌介导法应用于甜菜抗性基因的转化研究中，成功获得了抗孢囊线虫的转基因甜菜[39]；1990 年，甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）外壳蛋白（CP）基因被转入原生质中，成功表达并表现出抗病性[22]；1991 年，研究人员利用发根农杆菌将BNYVV 外壳蛋白（CP）基因转化到甜菜组织中，得到了可以在根毛中稳定表达CP基因的转基因甜菜植株[40-41]；1997 年，姚华建等[42]将体外克隆的CP基因成功转入甜菜植株的下胚轴和叶柄中，获得了对丛根病表现抗性的植株；2000 年，马龙彪等[43]通过几丁质酶基因获得抗真菌病转基因植株；2002年，徐德昌等[44]通过CP基因获得了抗丛根病后代转基因甜菜；2002 年，研究人员从甜菜中克隆出HS1pro-1基因，并转入甜菜获得抗线虫植株[39，45]；2004年，KONSTANTINOS[22]从番茄中克隆出过氧化物歧化酶基因，将其转入甜菜中，获得抗氧化胁迫、抗真菌感染的转基因植株；2007 年，孙亚卿[46]克隆RIPs基因并转入甜菜中，获得抗丛根病和褐斑病转基因植株。

3 抗虫转基因甜菜的研究

目前，抗虫转基因甜菜的研究主要围绕抗甜菜夜蛾和甘蓝夜蛾展开。1996 年，日本甜菜协会将苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）基因导入甜菜，初步研发出对甘蓝夜蛾表现抗性的材料，后续实验将抗虫基因导入并整合到甜菜野生种基因组中，成功培育出日本第一例抗甜菜夜蛾的基因重组型植株，之后研究人员成功从Bt菌中进一步分离得到对甘蓝夜蛾具有高效杀伤力的目标基因，并将其导入甜菜植株[47]；1999 年，日本北海道大学的岛本义也等利用农杆菌介导法，成功将Bt的cryIA（b）基因导入甜菜自交系‘NK150’和‘TK80’中，并得到其杀虫活性的高效表达[48]；2003 年，陈中义等从Bt分离菌株中获得了cry1Ca基因，该基因对甜菜夜蛾具有高效毒杀作用[49-50]；目前，Bt毒素基因在甜菜夜蛾的有效防控中发挥了重要作用，相关技术体系和配套衍生产品也日益丰富[47]。

4 抗（耐）除草剂转基因甜菜的研究

多年的田间试验表明，种植田中的杂草是甜菜产量和含糖的主要限制因素[51]。杂草的有效控制是甜菜种植中最重要的问题，特别是确定不同品种的防治关键时期。土耳其研究者开展了甜菜季节性生长期的田间试验，评价了甜菜作物的临界杂草控制期（CPWC），在一定程度上提高了杂草防控的选择性和靶标性[52]。

目前甜菜生产中可供选择的除草剂种类很少[53]，苗期主要使用封闭除草，多选择金都尔（精-异丙甲草胺），是先正达公司在全球销量最大的一种选择性除草剂；苗后主要选择甜菜安宁和安宁乙呋黄等除草剂[54]。但在实际生产中，金都尔作为一种选择性芽前除草剂，仅对于多种单子叶杂草、一年生莎草和少部分一年生双子叶杂草防效较高；甜菜安宁等药剂的安全剂量、最佳喷药时间和安全间隔期误差较大，容易错失杂草的最佳防治期导致防治效率降低，或用药过量造成苗期药害[54]。据不完全统计，在我国各大甜菜主产区，杂草危害每年造成的经济损失可达甜菜总产量的5%～10%，部分地区高达20%～30%，危害严重的种植地块会因此绝产或弃收[1]。抗（耐）除草剂转基因甜菜（GMHT）的研发一直是转基因技术的主攻方向，其中，最具代表性的是抗草甘膦和抗草铵膦转基因甜菜的商业化应用[55-56]。

4.1 抗（耐）草甘膦转基因甜菜

草甘膦（Glyphosate），别名N-（磷酸甲基）甘氨酸，商品名称农达（Roundup），是20 世纪70 年代初期由（原）孟山都公司研发的一种非选择性内吸传导型有机磷类除草剂。草甘膦因其十分稳定的理化性质，具有高效、广谱、低毒、低残留、不破坏土壤环境等优点，对多数靶标植物具有灭生性，强大的内吸传导性能不仅可以杀死杂草地上部分，同时也可以通过茎叶传导到地下部分，根除多年生深根杂草。草甘膦作用机理主要是通过抑制植物体内5-烯醇丙酮莽草酸酯合成酶（EPSPS），阻碍莽草酸合成，从而阻断植物体内所必需的芳香族氨基酸生物合成，最终导致植物死亡[54]。已有研究表明，作物对草甘膦产生抗药性的作用机理，主要是通过以下两种方式：一种是epsps基因发生突变，生成与草甘膦亲和性较低的EPSP 合酶；另一种是epsps基因的大量扩增或过量表达，产生的EPSPS合酶活性过高，从而破坏了草甘膦对靶标作物的抑制作用[57]。

抗（耐）除草剂转基因甜菜的研究始于20 世纪90 年代。1998 年，诺华公司和（原）孟山都公司通过农杆菌介导法将cp4-epsps基因和goxv247基因导入甜菜，获得抗草甘膦转基因甜菜品种‘GTSB77’，同年美国环境保护局批准该品种在本土种植，可用于食品和饲料[22]；1999 年4 月，美国环境保护局正式批准抗草甘膦转基因甜菜在本土的大面积商业化种植；2005年（原）孟山都公司和德国KWS 公司将cp4-epsps基因导入受体甜菜，cp4-epsps基因可以编码对草甘膦不敏感的CP4-EPSPS 蛋白，从而获得了抗草甘膦转基因甜菜H7-1，2003 年日本率先批准其食用，2004 年美国食品与药品管理局（FDA）批准其食用和饲用，2005 年美国农业部（USDA/AHPIS）和加拿大批准其商品化种植[22]。

4.2 抗（耐）草铵膦转基因甜菜

草铵膦（Glufosinate ammonium）别名草丁膦，商品名保试达。是20世纪80年代由拜耳公司开发的一种广谱触杀型灭生性除草剂。该药剂属于磷酸类除草剂，通过抑制植物氮代谢途径中谷氨酰胺合成酶，干扰植物正常的生理代谢，使其死亡。生产中，草铵膦具有毒性低、活性高和环境相容性好等特点，由于其活性作用的发挥速度比百草枯慢，却比草甘膦快，因此3种药剂成为并存可使用的非选择性除草剂。针对草甘膦敏感性高的杂草，田间产生抗药性后草铵膦可作为替代品，合理轮换，交叉使用，从而有效缓解或抑制抗药性的发展。

拜耳公司利用农杆菌介导法将pat基因和nptⅡ基因导入甜菜品种中，成功培育出对草铵膦表现抗性的转基因甜菜品种‘T120-7’[22]。1998 年，美国率先批准了该品种在本土的商业化种植，规定可食用和饲用；1999 年，日本批准了食用和饲用；2000 年，加拿大批准该品种可用于食品加工，2001 年批准其在本国的商业化种植和饲用加工[22]。

4.3 转基因抗（耐）除草剂甜菜的优势

目前，（原）孟山都公司已经推出了两种商用抗除草剂转基因甜菜，分别是Roundup ReadyTM（RR，抗草甘膦和Auentis）及Liberty LinkTM（LL，抗草铵膦），全球已用于商业化应用的主要抗除草剂转基因甜菜品种或品系有‘GTSB77’、‘H7-1’、‘T120-7’、‘T9100152’等[1]。经过基因修饰的甜菜品种或品系可以对广谱性除草剂产生耐性，在有效杀死杂草的同时，不伤害作物，因此受到种植者的青睐。转基因甜菜栽培最直接的影响是对除草剂使用制度的改变，种植者可选择在苗期后施用除草剂，在生长季节施用2～3次，从而改变混合多次使用不同选择性除草剂的弊端，提高防治效率，显著降低除草剂使用剂量[58]；抗除草剂作物和除草剂组合的田间杂草防控体系，在一定程度上可以减少耕作次数或实现免耕，据统计，转基因甜菜的种植可以减少50%的耕作次数，从而有效保持土壤水分、减少土壤侵蚀[58-59]；同时可节省30%的燃油，不用人工除草，节省劳动力，降低杂草防控成本，为田间杂草的高效管理提供更多的灵活性和便捷性[59]。

5 转基因甜菜的安全性

5.1 转基因甜菜的遗传稳定性及对环境的安全性

目标性状基因通过特定方法导入转化体中，可以稳定地通过单位点单拷贝的形式有效整合进甜菜基因组，在后代中按照孟德尔遗传方式稳定遗传[60]。

甜菜为二年生作物，第一年营养生长，第二年生殖生长，经抽薹、开花、受精形成种子。糖用甜菜收获块根，生产中在第一年（营养生长时期）采收，有性繁殖器官没有发育起来，开花几率很小[60]。甜菜主要通过风媒传粉和有限的虫媒传粉，属于自我不亲和性植物,原料田与同属其他物种或野生甜菜很难进行异花授粉，因此在野生亲缘种和糖用甜菜栽培种之间，不会发生基因漂移。生产中因花粉调节引发基因漂移的可能性很小，即使有因环境条件诱发的抽薹现象，可通过农艺方法结合选用抗抽薹新品种加以控制[60]。

5.2 转基因甜菜对人类健康的安全性

国际食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission）制定了转基因植物及其产品安全评价的风险评估原则，所有投入生产的转基因甜菜，目标性状基因或关键性作用蛋白均通过小鼠急性口服毒性试验，证明其无毒性或可达到安全标准[61]。针对转化体的重要营养元素和成分开展组成分析，数据表明，转化体的主要营养元素或成分的营养价值等同于非转基因分离对照物，且居于糖用甜菜品种的观察值域内[61-62]。根据现有甜菜加工制糖工艺流程，加工活动不会影响转基因甜菜的安全性，加工糖中极少含有转基因成分[61]。

根据农业农村部转基因生物安全等级和产品生产、加工对其安全等级的影响程度，研发公司需要对受体、基因操作、转基因植物及转基因产品等多方面开展全面安全评价，包括基因操作、环境、生态、毒性和食品安全等[63-64]。综合多方面数据，依据《农业转基因生物安全评价管理办法》，为转基因植物或产品划分安全等级，依法授予转基因生物生产应用和加工原料进口安全证书[65]。综上所述，在现有的技术和法律手段下，可确保转基因甜菜的安全性。

6 转基因和基因编辑技术在我国甜菜产业中的应用展望

截止2020年底，我国只批准了（原）孟山都远东有限公司科沃施种子欧洲股份公司的抗除草剂转基因甜菜H7-1 的进口生物安全证书。相关审批制度明确规定，作为加工原料进口的农业转基因生物，严格禁止在国内种植。目前，我国只批准了抗虫转基因棉花和抗病毒病转基因番木瓜的商业化种植[66]。

以转基因和基因编辑技术为代表的遗传修饰技术，代表着现代生物学发展的最前沿，也是推动现代农业科技迭代和现代农业变革的一项关键性技术[66-67]。转基因作物商业化种植的24 年以来，转基因技术为全世界创造了巨大的财富，同时为许多人类棘手问题的解决提供了全新的思考和路径。基因编辑技术作为近年来生命科学领域的重大突破，已然成为新的技术窗口。近期，日本和美国FDA 分别批准了基因编辑番茄的销售申请和基因编辑猪在食品和医疗两大领域的使用[67]。目前就基因编辑技术的研发而言，我国和美国一同处于领先地位，但是在应用方面，美国和日本已经出台了许多实质性政策，而我国还未有相关基因编辑产品的批准[67]。我国应积极参与全球科技竞争，加强转基因和基因编辑技术在甜菜等主要作物品质改良中的研究，特别是集中力量攻克优质品种选育这一“卡脖子”的技术难题。

我国既是一个农业生产大国，也是一个农产品消费大国。2008 年，国务院常务会议审议通过了转基因生物新品种培育重大专项，作为我国农业领域唯一一个国家重大科技专项，旨在推动我国农业科技的跨越式发展[66]。其中，中国农业科学院植物保护研究所承担了Cry1Ab和Cry1Ac对粘虫、甜菜夜蛾及其天敌安全性评价的转基因动植物安全评价课题；2010 年，生物育种被国务院正式列入国家战略性新兴产业规划[66]；2017年，中央1号文件再次强调依法加强对农业转基因技术的研发和监管，确保转基因技术和转基因产品的安全性，在重点研发领域慎重分批次逐步推广[66]；2020 年，生物育种再一次作为国家战略性重大科技项目，写进“十四五”规划纲要；中央经济工作会议强调，要开展种源“卡脖子”技术攻关，立志打一场种业翻身仗；2021年，农业农村部发布了《2021 年农业转基因生物监管工作方案》，新增依法加快推进生物育种研发应用，强调积极推动各省级农业农村部门将农业转基因监管纳入政府议事日程，将支持农业转基因生物安全事业发展的相关支出列入政府预算；2021 年，农业农村部办公厅下发《关于鼓励农业转基因生物原始创新和规范生物材料转移转让转育的通知》。有分析认为，2021 年转基因品种审定法案或许即将出台，中国有望进入主粮转基因种植元年[68]。然而，我国尚未对甜菜转基因和基因编辑技术进行专项资助，在一定程度上延缓了生物技术在甜菜育种等方面的应用进展[69]。

目前，我国糖料产业正处于高质量发展的关键时期，如何提升我国食糖产业的综合竞争力，有效保障我国食糖有效供应和谋划“十四五”期间国家食糖产业规划，我们应着眼于未来国际食糖产业的竞争与分工，积极争取国家转基因生物新品种培育重大专项等科技攻关项目对甜菜品种选育和品质改良等方面的支持，加紧抗病虫和抗除草剂转基因甜菜新材料的创制和新品种培育，特别注重基因编辑技术在甜菜基因功能研究和创制新材料上的应用，充分发挥我国在基因编辑技术研究领域领先优势，努力抢占全球新一轮经济科技革命竞争制高点，依法加快转基因和基因编辑技术的研究与成果应用步伐，为我国糖料产业的可持续发展提供强有力的科技支撑。