糖尿病性视网膜病变的早期病理改变与检测手段研究进展

蒲家欣 综述，周希瑗审校

(1.重庆医科大学，重庆 400010；2.重庆医科大学附属第二医院眼科，重庆 400010)

糖尿病性视网膜病变(DR)是一种由长期高血糖状态诱导产生并发展的，严重威胁视力、最终导致失明的眼部微血管并发症。随着我国人群生活方式的改变,糖尿病的患病率也逐年升高,其造成的包括糖尿病性周围神经病变、糖尿病肾病、DR等相关并发症患者也逐年增多。我国不断升高的DR患病率警醒着医务工作者不断对该病的发生机制与检测手段的进行研究，以尽早预防、尽早诊断、尽早治疗。本文将目前国内外DR早期病理机制与检测手段进行综述如下。

1 病理机制

视网膜是人体内代谢高度活跃的组织，从光感受器到大脑视觉中枢，神经元在神经胶质和血管组织的支持下将电化学信号传递到大脑，而神经元的正常代谢与视网膜组织内各类型细胞功能上的协调运作密切相关，其中血-视网膜屏障(BRB)在其中起着至关重要的作用。这种动态系统会受到高血糖的干扰，导致严重的血管异常、BRB丧失和神经元功能受损。目前普遍认为早期DR的病理改变是高血糖所导致的以内皮细胞损害、基底膜增厚、周细胞凋亡为特点的视网膜微血管病变。但国内外陆续有研究表明，在视网膜微血管异常发生之前，视网膜电流图(ERG)等检查结果即可发生异常，表明视网膜神经病变的发生可能先于视网膜微血管病变。

1.1早期DR与视网膜微血管病变 经典的理论认为血管病变引起了DR，且高血糖在糖尿病视网膜血管病变的诱导中起着核心作用[1]。长期处于高渗状态的管壁内血液刺激基底膜进行性增厚、周细胞死亡、微动脉瘤形成及渗出和出血改变，正常血管结构的破坏进一步导致周围视网膜组织的缺血，从而刺激血管生长因子的产生与新生血管的形成，进一步加重缺血[2]。在非肥胖糖尿病小鼠(NOD小鼠)中进行的研究表明，暴露在高糖水平1周后的小鼠中已经可观察到BRB的破坏。DR经高糖状态诱导产生后，病理改变的下一个活跃阶段被认为与缺氧及炎性反应密切相关[3]，而在糖尿病所引发的炎症过程中，无论是发病初期或晚期，局部或全身，多种炎性蛋白与细胞因子的参与是该过程的关键因素。

研究表明，在参与DR炎性反应过程的细胞因子中，白细胞介素-10(IL-10)、IL-34、IL-6、IL-8、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、转化生长因子-β(TGF-β)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等细胞因子发挥着重要的作用[4]。

视网膜缺氧诱发的VEGF分泌量上调可在Muller细胞、星形胶质细胞、视网膜色素上皮细胞、周细胞中检测到。作为一种相对分子质量为46～48 kDa的糖基化同型二聚体，VEGF是一种对血管生理性与病理性增生起着重要作用的蛋白质。VEGF-B 与VEGFR-1 结合促进血管生长、调节血管通透。 VEGF-C/D 结合 VEGFR-3 促进淋巴管的生成和转移，同时也结合VEGFR-2 促进视网膜新生血管生成和通透性增加[5]。研究表明，在发现视网膜灌注不良的形态学证据和视网膜新生血管之前，就可检测到VEGF的分泌增强，说明VEGF的表达早于新生血管的生成，缺血可能不是刺激VEGF表达上调的唯一诱因[6]。

在FALKOWSKI等[4]一项最新研究中，通过检测受试者血液中生长/分化因子15(GDF-15)、金属蛋白酶2(MMP-2)、EGF和IL-29等浓度，并对结果进行多元逻辑回归分析，发现EGF水平的升高在多个糖尿病相关微血管病变中均具有统计学意义。TNF-α在DR的发生、发展过程中的作用也同样不可忽视。作为一种多效促炎细胞因子，TNF-α是TNF超家族22种蛋白之一，调节细胞生长和分化，除了参与炎症过程外，也对新血管的形成有抑制或刺激作用。MGUISHO等[7]使用NOD小鼠模型，证明了TNF-α进入玻璃体会导致血管内皮缺血和视网膜坏死，这一发现再次证明了TNF-α在DR的发病机制中的作用。同时，研究发现，持续的高血糖环境会导致视网膜晚期糖基化终产物(AGEs)的累积，AGEs受体(RAGE)在视网膜多种类型的细胞中均有表达，其被发现在糖尿病患者的视网膜中表达上调。AGEs与RAGE结合会引起密集的细胞内信号级联反应，导致内皮功能障碍，同时上调关键性促炎因子和促血管生成因子(如TNF-α和IL-1)、核转录因子NF-κB、VEGF、黏附分子等，介导周细胞凋亡、血管炎症和血管生成，以及内BRB的破裂，从而发挥其视网膜毒性作用[8]。

1.2早期DR与视网膜神经病变 视网膜神经血管单元包括神经元、胶质细胞和血管之间的物理、生化关系，血管单元的损伤与神经单元的损伤密不可分。生前已完善眼科检查并未发现任何血管病变的糖尿病患者，在其死亡后捐赠的视网膜中，已经检测到包括细胞凋亡和神经胶质细胞激活在内的神经退行性病变[9]。视网膜神经病变的机制与谷氨酸积累、神经保护因子缺乏、氧化应激、神经炎症密切相关。

作为视网膜中神经兴奋传导的主要神经递质，谷氨酸参与光刺激沿着光感受器到神经节细胞的神经传递过程。在糖尿病的实验模型及糖尿病患者的玻璃体液中，在视网膜病变性形成之前，已发现了谷氨酸水平的升高[10]。目前认为，谷氨酸水平升高的机制主要为：(1)Muller细胞内谷氨酰胺合成酶功能障碍；(2)视网膜细胞将谷氨酸转化为α-酮戊二酸盐的功能受损；(3)神经胶质细胞对谷氨酸利用能力受损。最终，积累的谷氨酸通过增加视网膜神经节细胞和淀粉蛋白细胞内的钙含量，进而启动细胞凋亡机制。

神经退行性病变过程中会产生大量神经毒性分子，视网膜细胞合成的神经保护因子通过抵消这一毒性因素，保护神经细胞的正常功能。众多研究表明，以色素上皮来源因子(PEDF)、生长抑素(SST)、促红细胞生成素(EPO)为主的神经保护因子，在试验对象的视网膜组织中含量明显上调，且抑制这类因子可能延缓DR进展，再次验证了这类因子参与了糖尿病视网膜病变的发生、发展过程[11]。

另一个在神经病变的发病机制中起重要作用的是氧化应激。事实上，视网膜是唯一直接且频繁暴露于光照的神经组织，这种暴露导致了许多脂质的光氧化，特别是多不饱和脂肪酸(主要位于光感受器外段)和胆固醇酯，这些氧化的脂质对视网膜细胞产生了极大的毒性。在DR中，与糖尿病相关的氧化应激和脂质过氧化反应的增加更是加剧了这一过程[12]。

同时，糖尿病患者视网膜形成了一种失调的促炎因子作用的复杂环境，其中小胶质细胞和浸润性单核细胞可能为最主要的参与者，通过对糖尿病大鼠整个视网膜的基因组评估发现，炎症基因CCLCC2、ICAM-1、STAT3、CCR5和CD44的表达均有一定程度的增加[13]，说明了神经炎症在DR神经病变发展中的潜在作用。

1.3视网膜微血管病变与神经病变的相互关系 神经元、神经胶质细胞与血管之间通过相互作用构成了视网膜神经-血管单元。BRB构成单位即为神经单位(神经节细胞和胶质细胞)和血管单位(内皮细胞和周细胞)构成的视网膜神经-血管单位与视网膜色素上皮细胞(RPE)，其对于调节血液中的溶质和营养物质、维持内层视网膜的微环境稳态具有显著作用。由此可见，神经单元与血管单元中任一病变出现时，即可导致神经-血管单元损伤，影响BRB的生理功能，从而进一步加速病变的发生、发展。虽然DR的微血管病变目前已经得到广泛研究，视网膜神经病变仍在临床研究中，参与介导神经视网膜退行性变和微血管变化的介质目前尚未确认。

VEGF在DR的早期阶段显著升高，关于VEGF是否是神经病变与微血管病变之间的介导因素目前仍在探索中。同时，研究者也对其他一些可能作为介导因素重要分子进行研究，如肾上腺素、信号素和神经素，这些因子可能由早期受损的神经细胞释放后发挥作用，加速DR的发展[14]。

目前，关于神经病变与微血管病变的先后顺序仍无定论，关于其之间的相关性仍在进一步研究中，其中VEGF等众多的细胞因子与氧化应激过程可能成为病变之间的介导因素。

2 检测手段

在一段比较长的时间内，虽然糖尿病患者的视网膜已发生早期的神经病变或是微血管病变，但临床可观察到的DR相关体征仍没有出现，当临床体征出现时，神经病变与微血管病变常常已发展到不可逆阶段，所以，早期确诊DR与筛查DR高危患者对于及时开展相关预防及治疗至关重要。以下总结了目前得到广泛关注与研究的早期DR相关检测手段。

2.1视网膜结构改变检测手段 在动物实验模型中，糖尿病发生1月后即能检测到视网膜神经细胞凋亡。同样，无论是否存在这一现象：BARBER等[15]在死亡后2月的患有糖尿病的人体视网膜中均可检测到神经节细胞的凋亡，谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)可通过直接、准确的测量体内视网膜厚度，使发现亚临床期DR神经上皮层视网膜结构变化。在无DR的糖尿病患者中，运用SD-OCT发现视网膜厚度变薄最先出现在内层视网膜，而外层视网膜受到的影响较小[16]。在一项纵向研究中，内层视网膜在1年的随访中呈进展性变薄，据统计厚度减少率为每年0.53 mm，并与视网膜功能改变密切相关[17]。总体来说，OCT检查结果提示视网膜神经退行性病变发生在视网膜血管损伤出现之前的糖尿病早期阶段，但由于早期影像特征目前在OCT上是非特异性的，OCT尚未被用作早期检测DR的可靠仪器。

OCT血管造影(OCTA)作为一种新的无创成像系统，可将视网膜和脉络膜血管可视化。DE CARLO等[18]最早开始用OCTA进行DR的研究，发现在糖尿病患者出现DR之前，即可检测到扩大的视网膜中心凹无血管区(FAZ)面积和毛细血管间无灌注区。近几年，较新的软件算法提供了更准确的相关参数，用于量化视网膜和脉络膜血管情况。近期，DIMITROVA等[19]发现2型糖尿病患者出现DR之前表层及深层毛细血管丛密度降低、血流速度降低及FAZ面积扩大。所以，OCTA可作为视网膜结构早期改变的检测手段。

除此之外，目前正在研究的早期检测DR的一种颇有前景的参考指标还包括视网膜血管直径的变化。鉴于糖尿病对视网膜血管的突出影响，研究人员通过数年的随访，发现更大的视网膜血管直径预示着更高的发病率与更严重的疾病程度，而血管直径的变化值相较于其绝对值灵敏度更高[20]。同时，血管直径以外的一些血管结构指标，包括弯曲度、分形维数和分支夹角，同样被认为是早期疾病的指标。但是，由于目前缺乏对于众多指标明确的一个异常界定值，所以其暂未得到广泛的临床运用。

2.2视网膜功能改变检测手段 通过对视网膜进行电生理评估，多焦视网膜电图(mfERG)目前是检测视网膜黄斑功能的一种高灵敏度评估方法。因为与健康对照组相比，无DR的糖尿病患者mfERG检测结果中潜伏时间显著增加，且除了潜伏时间延长以外，在无DR的DM患者中，也发现了mfERG振幅的下降[21]，但振幅的改变在预测DR发展上证据学并不充分，可能是由于受试者之间的主观差异，且振幅的改变往往需要更大的视网膜细胞损伤量，所以，目前对于mfERG振幅的改变与DR发展的关系还需要进一步研究。在标准的ERG中，5个经典反应可用于评估整个视网膜对光刺激的电生理反应。其中，代表内层视网膜细胞间相互作用(主要是无分泌细胞)的ERG振荡电位，与视网膜缺血性改变表现出一定的相关性；在无DR的糖尿病患者BRB尚未受到损伤时，已经发现振荡电位异常，再次提示在微血管病变出现之前已发生早期功能学改变。

微视野检查是一种主观性的视网膜功能相关检查，检查结果往往与视网膜结构改变区域相对应，可以提供早期功能学改变证据。研究发现，相较于无DR的健康人，糖尿病患者在未出现DR之前，通过微视野检查可发现中央凹敏感性降低，且中央凹敏感性降低区域在一定程度上与SD-OCT所测得的感光细胞层厚度、神经节细胞层-内丛状层厚度、视网膜神经纤维层厚度，以及糖尿病性神经病变严重程度相关[22]。

对比灵敏度(CS)的改变目前已被证实可发生在无DR的糖尿病患者中，甚至在 Snellen视力表检测结果正常的患者中，也能检测到CS的异常。但是，目前尚无统一标准来衡量早期CS改变的程度，主要原因是该检测方式极大程度上受到测试的主观性、测试技术与测试条件的限制。在对伴有DR与不伴DR的糖尿病患者进行研究中，DURN等[23]发现伴有DR的糖尿病患者测得的CS与低对比度视力均较差。因此，CS的检测为早期发现、控制、逆转视网膜功能变化具有重大意义，但关于其统一衡量标准还需进一步探索。

据目前研究，作者认为在糖尿病的进展中，其视网膜的氧代谢情况发生了变化。DR早期视网膜血流速率下降与视网膜脉络膜的微血管循环异常密切相关，此时光感受器的耗氧量增加，动静脉氧饱和度差增加。在一项最新的研究中，HARDARSON等[24]发现，随着时间推移，糖尿病患者视网膜大血管内血氧饱和度增加，动静脉压差减少，而视网膜病变分级无明显变化。这项研究结果表明，视网膜血氧饱和度的变化可能先于DR的分级进展，且血氧饱和度变化程度对疾病进展的评估比DR分级标准更敏感[24]。但同时作者也发现，在不同的研究中，动静脉氧饱和度的变化似乎不尽相同，这可能与每项研究中测量血氧饱和度的检测手段不同相关。

2.3分子生物标志物 血液或局部组织中的分子生物标志物通过参与DR发生、发展的不同阶段，可以用于评估DR病理或生理过程的指标。目前，已有许多研究证实了DR不同阶段的各种生物标志物，本综述仅对DR临床前期的生物标志物进行归纳总结。

通过缺血诱导，由血管内皮分泌的VEGF，作用在于提升血管通透性和促进新生血管形成。LIU等[25]通过将健康对照组与 DR 的不同阶段的血清中VEGF水平相对比，可以发现，在没有 DR 的糖尿病患者中，VEGF水平显著升高，并随着病情严重程度的增加而增加。视网膜分子成像技术的进展有助于在无创条件下将目标标记物可视化，这对于早期检测DR具有临床意义。SUN等[26]通过该种方式对糖尿病大鼠视网膜毛细血管进行分析，发现与对照组相比，其内皮细胞中VEGF受体2的表达增加，且这一发现与临床试验结果相似，糖尿病患者视网膜组织中的VEGF受体2高于年龄匹配的健康对照组。以上现象均说明，VEGF分子与VEGF分子受体均可作为早期筛查DR的灵敏指标。

由于炎症参与DR的各个阶段，研究者对炎性生物标志物展开了研究，用于早期检测DR[27]。研究发现，与健康对照组相比，DR患者以IL-1a、IL-3、单核细胞趋化蛋白2、干扰素为代表的炎症细胞因子水平显著增加。同样，研究表明糖尿病患者的抗炎化合物脂蛋白A4和脑源性神经营养因子水平的下降也可能是DR的一个潜在评估指标[28-29]。在糖尿病微血管并发症的发展中起关键作用的AGEs是一种非酶促糖结合产物，其在糖尿病患者中增加并与受体结合激活促炎细胞因子的产生。研究发现，与健康受试者相比，没有 DR 的糖尿病受试者的AGEs水平显著增加，尤其是 N-ε羧甲基赖氨酸，且血清AGEs水平与DR严重程度呈正相关[29]。 除了血糖和糖化血红蛋白外，N-ε羧甲基赖氨酸被认为是 DR 发展的独立预测因子[30]。

总体来说，几乎所有的研究均表明，即使没有明显的视网膜病变的临床体征，视网膜功能和结构损伤的证据已存在。所以，早期对糖尿病患者进行视网膜病变相关筛查，发现高风险人群并及时予以预防与干预，是至关重要的。

3 小 结

通过对近年来关于DR的早期病理改变的相关研究总结发现，虽然目前病变发展的先后顺序仍无定论，但神经病变和脉管系统的改变均是导致DR 的重要因素。视网膜微血管改变与VEGF、TNF-α、EGF、TGF-β等多种细胞因子与血管之间的相互作用密切相关，而神经病变更多地与谷氨酸积累、神经保护因子缺乏、氧化应激、神经炎症等因素相关。参与介导神经视网膜退行性病变和微血管病变的介质目前尚未明确，其中VEGF等众多的细胞因子与氧化应激过程可能成为病变之间的介导因素。同时，在对早期病变最新检测手段的归纳中，OCT、OCTA及血管直径等结构相关性检测手段与mfERG、微视野检查、色觉检查、CS、氧代谢相关指标的功能性检测手段，以及VEGF、多种炎性因子、AGEs等生物标志物，均可发现DR病变之前的眼内环境改变。本文对近年来DR相关检测手段发展进行综述，旨在希望通过这些手段对糖尿病患者进行视网膜病变相关筛查，发现高风险人群，及时予以预防与干预。