天然产物中镇痛活性成分对TRPV1通道的调控作用

徐秀琦，李光，张广钦

(1.中国药科大学临床药学教研室，江苏 南京 211198；2.西南医科大学心血管研究所医学电生理学教育部重点实验室，四川 泸州 646000)

疼痛是组织损伤或潜在组织损伤所引起的不愉快感觉和情感体验[1]。疼痛通常是有害刺激引起的组织损伤的结果，它是人体防御系统的一个重要组成部分，但疼痛也严重影响了人们生活质量，有时甚至还伴有抑郁和焦虑。据估计，60%的65岁以上的成年人患有慢性疼痛，近70%的癌症患者和95%的脊髓损伤患者也经历慢性疼痛[2]。目前用于治疗疼痛的药物主要包括阿片类药物、非甾体抗炎药、抗惊厥药和抗抑郁药。阿片类药物是强效的镇痛药，但具有成瘾和呼吸抑制等严重不良反应；非甾体抗炎药的使用受到胃肠道和心血管系统的不良反应的限制；而抗癫痫药物加巴喷丁产生镇静和体重增加[3]。因此，需寻找安全、高效、低成瘾性的新型镇痛药物，从而改善疼痛治疗现状。

伤害性刺激经初级传入神经元转导为神经冲动，并沿着脊髓丘脑束到达脑干、丘脑和大脑皮层，痛觉信号被感知为疼痛[4]。在这些信号的传递并产生痛觉的过程中，离子通道如瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid1,TRPV1)发挥了重要的作用。TRPV1作为瞬时受体电位(transient receptor potential,TRP)通道家族成员之一，是研究最深入的一个，它被证实在感知有害刺激和痛觉感受器产生疼痛方面起着关键作用，是治疗急慢性疼痛的一个有前景的分子靶点。近年来研究发现，多种天然产物对TRPV1具有调节作用。目前已开发或具有开发潜力的天然化合物种类众多，包括香草醛类、黄酮类、生物碱类、萜类等。由于天然产物结构的多样性，天然产物在从经验性药物筛选到合理药物设计的过程中发挥着重要作用。本文就天然产物通过调节TRPV1发挥镇痛作用进行综述，为进一步的研究与开发新的镇痛药提供依据。

1 TRPV1与疼痛

TRPV1是一种配体门控的非选择性阳离子通道，主要分布于背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)和三叉神经节(trigeminal ganglion,TG)中、小直径细胞上。TRPV1可被内源性和外源性化学和物理刺激激活，包括伤害性热刺激(>42 ℃)、质子(pH<5.9)、炎症介质(缓激肽、神经生长因子、组胺)、香草醛类化合物(辣椒素)等。TRPV1通道允许Na+、K+、Ca2+、 Mg2+等多种阳离子通过，其中Ca2+具有较高的通透性。当机体受到伤害性刺激时，TRPV1激活，痛觉感受器释放多种神经肽，如P物质(substance P,SP) 和降钙素相关基因肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)，引发一系列重要的生理学反应[5]。

在炎性疼痛中，炎性介质是介导炎性反应及产生疼痛的内源性化学物质，大体分为两大类：细胞释放的炎症介质和体液中产生的炎症介质。与疼痛紧密相关的有前列腺素、组胺、缓激肽、5-羟色胺等，其中以缓激肽的作用最强。缓激肽释放后，其作用于B2受体，继而激活蛋白激酶C促进磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinosital biphosphate,PIP2)水解以产生三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)和甘油二酯(diacylglycerol,DAG)，这两种化合物均可影响TRPV1的功能，DAG是TRPV1激动剂，其与TRPV1结构域的酪氨酸相互作用[6]。PIP2结合到TRPV1通道的C末端以正向调节TRPV1[7]。前列腺素增加辣椒素诱导的DRG神经元中的电流并降低通道的温度激活阈值，其效应已在TRPV1基因敲除小鼠中得到证实[8]。在一些神经病理性疼痛的动物模型中，TRPV1的高表达与热痛觉过敏的发生和维持相关，TRPV1的拮抗剂可减轻疼痛。在疼痛性糖尿病神经病变模型中，动物表现为双相疼痛行为，特征是在疾病早期出现痛觉过敏，随后在后期出现痛觉减退[9-10]。TRPV1缺乏的小鼠没有出现糖尿病引起的热痛觉过敏的迹象，而药物抑制该通道可减少机械性异位痛[9]。在慢性疼痛模型中，利用脊髓切片法制备SG神经元，全细胞膜片钳记录发现，辣椒素激活TRPV1诱导的谷氨酸释放和内向电流增加，并且需要Ca2+内流，而不通过电压门控Ca2+通道[11]。此外，在骨癌引起的慢性疼痛中，由于TRPV1在DRG神经元中的过表达，导致神经病理性疼痛[12]。因此，TRPV1与疼痛关系密切。

TRPV1通道表现出两种脱敏：第一种是急性脱敏，即在持续存在激动剂的情况下TRPV1电流下降；第二种是快速耐受性，即重复使用激动剂导致较小的反应[13]。长时间接触激动剂会导致过量的钙进入神经纤维，引发可逆的痛觉感受器功能损害，从而缓解疼痛[14]。此外，刺激强度影响整个细胞快速耐受的程度，这是由TRPV1循环调节的[15]。长期脱敏是由于内吞作用导致驻留在质膜上的TRPV1水平改变，随后被溶酶体降解[16]。TRPV1通道的拮抗剂和激动剂分别可通过抑制通道活性或使通道脱敏发挥镇痛作用。目前，基于TRPV1为靶点的药物研究与开发逐渐增多，对可以调节TRPV1的天然产物的研究也越来越广泛，这为天然产物治疗疼痛提供了更多的理论依据。

2 天然产物对TRPV1 的调节

天然产物对TRPV1的调节作用具有多样性。在对这些天然产物的研究中，一些经典的实验方法用于判断化合物是否作用于TRPV1通道。大多数体外研究利用电生理和钙成像技术，通过大鼠或小鼠DRG和TG细胞研究TRPV1电流及细胞内Ca2+变化，有助于判断给定的化合物是TRPV1激动剂还是拮抗剂。在一些实验中，也使用hTRPV1或rTRPV1表达于HEK239、CHO细胞或非洲爪蟾卵母细胞。为了解释化合物与TRPV1通道的特异性结合位点，研究了一些天然产物与突变体TRPV1通道的结合亲和力[17]。[3H]-RTX结合实验用来研究该化合物取代RTX结合TRPV1能力。体内研究主要集中在小鼠和大鼠不同的疼痛模型上，观察天然产物引起疼痛或缓解疼痛的能力。常见的疼痛模型有:足底注射辣椒素致痛模型、辣椒素诱导的口面疼痛模型、慢性压迫性神经损伤模型、糖尿病神经病理性疼痛模型、角叉菜胶致痛模型、完全弗氏佐剂(complete Freund′s adjuvant,CFA)慢性炎症痛模型等。基于以上的实验方法，研究发现多种天然化合物具有调节TRPV1通道的功能。这些化合物通过不同方式调节TRPV1活性，属于不同的类型的化合物，包括香草醛类、黄酮类、生物碱类、萜类、萜基酚、脂肪酸、大麻素、含硫化合物等。

2.1 香草醛类

2.1.1 辣椒素 辣椒主要成分之一的辣椒素是TRPV1的特异性激动剂，其香草醛基对TRPV1的激活至关重要。辣椒素激活通道的开放引起钠离子和钙离子等阳离子进入细胞内，促进神经肽类物质和兴奋性氨基酸的合成和释放。辣椒素诱导的疼痛模型用于研究疼痛的机制，还可以在临床研究前测试新的TRPV1拮抗剂以及药物的临床疗效[18]。长时间或重复使用辣椒素，诱导钙依赖的TRPV1脱敏，从而使该通道对辣椒素和其他有害刺激不敏感，达到治疗疼痛的目的。

2.1.2 树脂毒素 树脂毒素(resiniferatoxin，RTX)是树脂大戟植物中发现的一种化学物质，是TRPV1最有效的激动剂。使用[3H]-RTX的结合研究已经成功地作为一个重要的药理学工具，用于研究选择性结合TRPV1的化合物。RTX与TRPV1结合，导致通道延长开放和细胞内钙大量增加。用RTX处理大鼠会引起体温过低、神经源性炎症和疼痛。单次给药时，辣椒素皮下注射最大耐受剂量仅能部分脱敏，而RTX可实现完全脱敏[19]。

2.1.3 姜酚 生姜与辣椒类似，也可以通过其香草醛类化合物激活TRPV1离子通道而引起刺激性反应。姜酚是生姜中具有生物活性的主要成分，包括6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚等。在rTRPV1-HEK293细胞中，姜酚促进细胞内Ca2+的增加。6-姜酚和8-姜酚在培养的DRG神经元中都能激发Ca2+瞬变和内向电流[20]。姜酚与TRPV1通道的结合方式与辣椒素相似，T551和E571两个氨基酸残基是其与TRPV1通道作用的关键位点[21]。分子对接的结果表明，2-姜酚、4-姜酚、6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚对TRPV1有较好的亲和力，其中6-姜酚与TRPV1的结合能力最强[22]。与辣椒素相比，6-姜酚对TRPV1的结合能力没有显著差异，有可能被用作治疗糖尿病神经病变的药物[23]。

2.2 黄酮类

2.2.1 黄芩苷 黄芩苷是从中药黄芩中提取的黄酮类化合物，对硝酸甘油诱发的大鼠偏头痛[24]和脊神经结扎大鼠神经性疼痛有镇痛作用[25]。在37 ℃和39 ℃条件下，黄芩苷均能下调DRG中TRPV1的mRNA的表达水平，在39 ℃条件下，在体外经黄芩苷孵育后，辣椒素诱发的细胞内钙荧光强度显著降低[26]。黄芩苷可以以剂量依赖的方式改善糖尿病神经病变大鼠的机械异位痛和热痛觉过敏，反复给予黄芩苷可降低糖尿病大鼠的神经痛和背根神经节神经元TRPV1的表达[27]。在慢性神经病理性疼痛大鼠DRG中，TRPV1和TRPA1 mRNA表达水平明显升高，黄芩苷可逆转周围神经损伤后DRG神经元TRPV1表达和细胞外信号调节激酶磷酸化水平。黄芩苷的镇痛作用与抑制TRPV1的表达有关。

2.2.2 圣草酚 圣草酚是黄酮类中的一种类黄酮，广泛存在于各种药用植物、柑橘类水果和蔬菜中。多项研究表明，圣草酚具有多种药理活性。圣草酚可减轻大鼠足部注射CFA引起的热痛觉过敏和机械异位痛，也可以预防大鼠足底和鞘内注射辣椒素引起的疼痛[28]。圣草酚能够降低[3H]-RTX的结合(IC50=47 nmol·L-1)并抑制辣椒素介导的钙内流(IC50=44 nmol·L-1)，证明它是TRPV1的拮抗剂[28]。圣草酚可作为TRPV1受体拮抗剂起到镇痛效果，而且没有其他TRPV1拮抗剂所导致的体温升高的不良反应。

2.3 生物碱类

2.3.1 黄连素 黄连素是一种具有广泛药理作用的天然异喹啉生物碱，可从黄连、黄柏和小檗等中药中提取。研究表明黄连素在某些病理性疼痛中具有镇痛作用。黄连素能改善糖尿病神经病变模型的异位痛[29]，降低PKCε和TRPV1的表达[30]。在神经性疼痛模型中，黄连素以剂量依赖的方式提高大鼠的机械和热痛阈值，可逆转周围神经损伤后背根神经节神经元TRPV1 mRNA和蛋白的表达上调[31]。此外，黄连素显著抑制辣椒素诱导的疼痛行为。这些研究结果突出了黄连素调节TRPV1的活性,并提示其在疼痛治疗中的潜力。

2.3.2 吴茱萸碱 吴茱萸是吴茱萸的一种果实，长期以来在传统中医治疗中被用作止痛药物。吴茱萸碱是一种天然的吲哚类生物碱，是吴茱萸的主要生物活性成分。吴茱萸碱已被报道具有与TRPV1活性相关的多种生物学作用，如抗炎、抗肿瘤、抗糖尿病和体温调节作用等。在体内的研究表明，吴茱萸碱可使小鼠对辣椒素敏感的感觉传入神经敏感或不敏感，从而产生致痛或镇痛的效果。吴茱萸碱的致痛作用被辣椒平共同给药而抑制[32]。吴茱萸碱是TRPV1的一种完全激动剂，它抑制了[3H]-RTX与rTRPV1的结合，在rTRPV1-CHO细胞中产生胞外Ca2+摄取和胞内Ca2+增加，这两种效应都被辣椒平阻断[33]。此外，吴茱萸碱体内预处理对大鼠足底注射辣椒素引起的热痛觉过敏有抑制作用，通过脱敏TRPV1抑制HEK293细胞中辣椒素诱导的电流[34]。因此，吴茱萸碱的镇痛作用可能是由于感觉神经元中TRPV1的激活后脱敏。

2.4 萜类

2.4.1 丁香酚 从丁香中提取的丁香酚广泛用于牙髓的麻醉。丁香酚和辣椒素在结构上的相似性表明这两种物质可能产生相似的效应。研究表明丁香酚可以激活TRPV1，在表达TRPV1的HEK 293细胞和三叉神经节神经元中，丁香酚能激活内向电流及升高胞内Ca2+，而TRPV1竞争性拮抗剂辣椒平和功能性拮抗剂钌红则完全阻断这些效应[35]。TRPV1至少有3种不同的激活模式，它们可以被辣椒素、热和质子等不同的刺激物选择性地诱导。丁香酚是TRPV1模式选择性拮抗剂，它抑制辣椒素诱导的TRPV1内向电流，在低浓度下增强质子诱导的TRPV1电流而在高浓度则为抑制作用，对热激活的TRPV1无调节作用[36]。丁香酚的模式特异性拮抗特性可用于开发一种无副作用的镇痛药物。

2.4.2 人参皂苷 人参作为中草药已经使用了一千年，用于治疗各种各样的疾病。在传统中医中，人参已被用于缓解各种类型的疼痛，如牙痛、腹痛、胸痛或神经痛。人参的主要生物活性成分为人参皂苷。越来越多的证据表明人参皂苷可以减轻注射辣椒素等有毒化学物质引起的疼痛[37]。人参皂苷Rb1抑制辣椒素诱导HaCaT细胞和HEK293T-TRPV1细胞产生IL-8和PGE2，并且抑制细胞中辣椒素诱导的钙内流和NF-κB转录活性[38]。人参皂苷Rg1阻断辣椒素和质子激活的细胞钙内流，抑制辣椒素诱导的角质形成细胞COX-2表达和NF-κB转录活性，剂量依赖性地抑制辣椒素诱导的HaCaT细胞和HEK293T-TRPV1细胞PGE2和IL-8的分泌[39]。然而，人参皂苷Rc在表达TRPV1的非洲爪蟾卵母细胞上不能激发电流，但能增加辣椒素诱导的内向电流[40]。人参皂苷对辣椒素诱导的疼痛行为的缓解源于它们与TRPV1通道功能的相互作用。这种相互作用似乎很复杂，因为人参皂苷可以作为TRPV1的激动剂或拮抗剂，其机制尚不明确。

2.5 大麻素类 多年来，大麻一直被用于医学治疗，由于其具有强烈的致幻作用且会产生成瘾性限制了它的应用。大麻素类化合物的发现与研究为大麻的合理运用提供理论依据。大麻素是大麻的主要活性成分，具有丰富的生物活性，如镇痛、抗炎、抗癫痫、抗惊厥、免疫调节等，可广泛应用于神经系统疾病、自身免疫性疾病、精神疾病、癌症等疾病的治疗[41]。目前已鉴定的大麻素类化合物已有100余种。研究表明大麻素通过大麻素受体1作用，部分阻断神经生长因子诱导的传入痛觉感受器神经末梢TRPV1的敏化而产生镇痛作用[42]。大麻二酚是非精神活性大麻素，一些作用与辣椒素类似，包括抗炎和镇痛作用。在表达hTRPV1的HEK293细胞中，大麻二酚抑制[3H]-RTX的结合并在较低浓度下增加胞内游离Ca2+，表现为TRPV1的完全激动作用[43]。四氢大麻酚和次大麻萜酚也可以激活hTRPV1 (EC50=1.0～2.0 mmol·L-1)。此外，一些大麻素化合物预处理细胞后使其TRPV1通道对辣椒素刺激脱敏，包括：四氢大麻酚酸、四氢大麻酚、大麻酚、大麻二酚、大麻二酚酸、大麻萜酚、次大麻萜酚和次大麻二酚[44]。一些内源性大麻素也可以激活TRPV1，如花生四烯乙醇胺和N-花生四烯酰多巴胺，也能激活TRPV1。内源性大麻素以“尾部向上，头部向下”的结构与TRPV1的香草醛结合袋结合，类似于辣椒素；然而，与TRPV1 Y512残留有一种独特的相互作用，这对TRPV1通道的内源性大麻素激活至关重要[45]。因此，大麻素是一个很有开发前景的候选镇痛药。

3 TRPV1调节剂在疼痛治疗中应用

一些以TRPV1为镇痛靶点的天然产物已经在开发或在临床应用。辣椒素已经在一些临床疾病中作为一种局部药物用于治疗疼痛，使用低剂量(0.075%)辣椒素乳膏或高剂量(8%)辣椒素贴剂进行局部治疗，用于治疗关节炎和皮肤病、肌肉疼痛、神经性疼痛和偏头痛[46]。珠卡赛辛是一种合成的天然辣椒素顺式异构体，在加拿大获得批准，这种外用药膏可有效缓解骨关节炎疼痛症状。帕尔瓦尼是一种类似辣椒素的非刺激性化合物，在辣椒属植物中少量发现，是比辣椒素更强的TRPV1脱敏剂[47]。与辣椒素相比，对小鼠进行全身镇痛治疗时，对体温和支气管收缩产生的不良影响较小[48]。RTX鞘内和神经节内注射也用于治疗疼痛。RTX被用作“分子手术刀”，因为它可以延长TRPV1通道的开放和钙内流，从而破坏细胞内线粒体代谢，导致神经细胞或神经纤维在几分钟内被破坏[49]。大麻提取物Sativex用于多发性硬化症患者神经性疼痛和严重癌症疼痛的辅助治疗[50]。由于TRPV1通道也存在于外周感觉神经元以外的其他组织中，这些受体的激活或失活可能产生严重的不良反应。TRPV1在下丘脑表达，它参与体温的调控。TRPV1拮抗剂因引起体温过高的副作用而限制了其临床应用。

4 总结与展望

疼痛的治疗依旧是临床治疗中需要面临的一项挑战。在初级传入神经元中发现与疼痛密切相关的TRPV1通道是一项重大突破。近年来，人们对天然产物调节TRPV1的机制研究逐渐增多，但从中发掘出安全有效并应用到临床中的TRPV1调节剂还需要更多的努力。在今后的研究中，需要结合临床研究，明确天然产物的疗效和副作用；充分利用分子对接和化学合成修饰天然产物的结构，产生更有效的类似物，提高安全性。希望在未来更多的天然产物及其衍生物开发成为TRPV1靶向镇痛药物。