麻风免疫诊断标记物研究进展

彭嘉怡 王洪生 余美文

中国医学科学院皮肤病医院，南京，210042

麻风是由麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae, ML)引起的慢性传染性疾病，主要侵犯皮肤、黏膜及周围神经，若未及时诊断及治疗，可导致畸残。目前麻风免疫诊断主要包括血清抗体、细胞因子水平检测。microRNA参与麻风分枝杆菌感染机体的免疫微环境，调节细胞因子分泌。其表达水平亦具有诊断价值。免疫标记物的具体临床应用及何种抗原及检测方法的敏感性和特异性更佳，一直是研究焦点。本文对血清学试验相关抗原、实验方法及临床应用、细胞因子及miRNA生物标记物近年来的研究进展进行综述，为后续有助于早期诊断麻风的研究提供参考。

1 血清学试验

1.1 血清学抗原

1.1.1 ML基因组诠释前 1981年首次发现酚糖酯抗原(PGL-1)有助于区分麻风分枝杆菌与其它分枝杆菌[1]。随后，Fujiwara等[2]以PGL-1为底物，通过苯丙酰基(Phenolic)或辛基(Octyl)将酚糖酯抗原的天然二糖(Natural Disaccharide)或三糖(Trisaccharide)结构连接到小牛血清蛋白(BSA)或人血清蛋白(HSA)，形成如NDO-BSA、NT-O-BSA等半合成糖蛋白抗原，发现其具有更强的免疫原性。起初，临床上主要使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗PGL-1抗体。蘸棒试验(dipstick assay)更为简便，其检测结果与ELISA高度一致，为97.2%，两者的血清阳性率亦无统计学差异[3]。2003年，一种新的横向流测试验(Lateral Flow test)问世，与ELISA结果的一致性为91%，诊断多菌型麻风的敏感性及特异性为97.4%及90.2%[4]。Van Hooij等[5]发现上转换发光技术侧流免疫夹心法(UCP-LFA)的MB总体检出率及敏感性较金侧流免疫夹心法(GOLD-LFA)高。PGL-1仍是目前应用最为广泛的血清学抗原，血清学检测相对无创，侧流试验等检测方法更是简便快捷，适用于现场开展，但尚不能有效取代皮肤活检。

1.1.2 ML基因组诠释后 2001年，Whitehead等[6]阐明了麻风分枝杆菌的基因组序列特征，发现麻风分枝杆菌基因组中仅有1604个(<50%)可编码蛋白的功能性基因。随着基因组时代的到来，在MB患者血清中发现越来越多重组蛋白诱导产生的特异性抗体。

目前较为广泛应用的重组蛋白为Leprosy IDRI Diagnostic(LID-1)，由麻风分枝杆菌抗原ML0405及ML2331融合形成，在症状尚未出现前6～8个月即可检测到其抗体，因此其可早期诊断麻风[7]。亦有研究发现联合化疗后血清抗LID-1抗体水平显著下降，因此LID-1亦可用于疗效评估[8]。Duthie等[9]研发了基于NDO-BSA及LID-1的融合蛋白NDO-LID的侧流层析法。与PGL-1相比，NDO-LID的MB和PB患者检出率及诊断特异性更高，检出率分别为87%和81.7%，特异性为97.4%。Chen等[10]的研究发现NDO-LID快速试验敏感性高，而ELISA法特异性较高，治疗前后NDO-LID抗体水平的差异表明其可辅助评估联合化疗效果。虽然NDO-LID已被证实在MB患者中有较高的血清学阳性率，Gomes等[11]发现女性、非棕色皮肤、生活在城镇及和超过5个人同居均会影响抗NDO-LID抗体阳性率。但由于纳入研究的样本量小，仍需扩大样本及在不同地区及人群中验证上述因素与NDO-LID抗体阳性率的相关性。

1.2 血清学试验的临床应用 血清学检测主要应用于麻风诊断、预测麻风反应、评估联合化疗效果、监测普通人群及家庭内接触者。

1.2.1 用于麻风诊断 目前血清学试验已广泛应用于诊断麻风患者。Chen等[10]在我国云南麻风高发区对83例麻风患者及161名非麻风对照组人群的研究中发现，NDO-LID快速试验及LID-1、NDO-LID及NDO-BSA的ELISA在MB患者中的阳性应答率均高于PB患者。其中NDO-LID快速实验的MB患者阳性应答率最高，为94.7%，敏感性较ELISA高而特异性较低。Marçal等[12]亦发现MB患者中抗NDO-HSA的IgM抗体、抗LID-1的IgG抗体及抗NDO-LID的IgG/M抗体滴度显著增加，其中LID-1和NDO-LID的IgG1亚型血清学试验的诊断性能较佳。Wang等[13]发现瘤型麻风(LL)患者NDO-BSA、主要膜蛋白II(Major membrane protein II,MMP-II)及LID-1血清阳性率分别为78.7%、59.3%及71.7%。三种抗原两两组合的血清学试验中，NDO-BSA和LID-1的血清阳性率最高，为86.3%,表明多抗原联合的血清学试验可应用于麻风早期诊断及监测。重组抗原可提高血清学诊断的敏感性及特异性，尚需进一步研发新的具有较高敏感性及特异性的重组蛋白。

1.2.2 预测麻风反应 麻风反应分为I型麻风反应，即逆向反应(RR)和II型麻风反应，即麻风性结节性红斑(ENL)。Hungria等[14]对452例无麻风反应的麻风患者进行研究，并用ELISA检测其抗PGL-1、抗LID-1及抗ND-O-LID的IgM和IgG抗体滴度。其中36%患者在随访期间发生麻风反应，26%的患者发生RR和10%的患有ENL。尽管其抗PGL-1抗体水平较无麻风反应的高，PGL-1血清学试验预测RR价值有限。而LID-1血清学试验可预测查菌阳性患者ENL的发生。Serrano-Coll等[15]研究纳入麻风反应患者及非麻风反应患者各40例，检测其血清中抗NDO-LID的IgG及IgM抗体，结果显示有麻风反应的患者抗NDO-LID的IgM及IgG抗体阳性率分别为52.5%及60%,均高于无麻风反应患者。因此，抗NDO-LID抗体可辅助预测麻风反应的发生。Devides等[16]纳入224例麻风患者，其中61例患有RR及12例患有ENL，随访5年期间有29例患者发生麻风反应。检测其抗PGL-1及抗NDO-LID-1抗体水平，发现非麻风反应患者抗PGL-1及抗NDO-LID抗体阳性率分别为19.2%及32.4%，RR患者的PGL-1及NDO-LID-1抗体阳性率分别为27.8%和50.8%，而ENL患者的PGL-1和NDO-LID-1抗体阳性率为66.6%和91.6%。本研究提示抗PGL-1及抗NDO-LID-1血清学试验有助诊断ENL，而NDO-LID-1的价值更佳。Duthie等[17]发现ENL患者抗NDO-LID抗体阳性率高于无麻风反应及RR患者。尽管较高的初始NDO-LID抗体水平是ENL发生的危险因素，但NDO-LID的快速检测方法及ELISA法均不能有效预测麻风反应发生的时间。

1.2.3 评估疗效 Hungria等[18]纳入263例MB患者，其中142例MB患者给予6个月联合化疗，另外121例给予12个月联合化疗，结果显示两组麻风患者治疗期间及治疗后抗PGL-1及抗NDO-LID抗体水平均下降，表明麻风特异性血清抗体滴度可反映联合化疗效果。

1.2.4 监测家庭接触者(HHCs) HHCs患麻风风险显著高于普通人群[13]。Do Carmo Gonçalves等[19]纳入64名家庭内密切接触者及1623名家庭周围接触者，发现家庭内密切接触者NDO-LID血清学阳性率为3.7%，高于家庭周围接触者。此外，家庭内接触者麻风患病率亦显著高于家庭周围接触者。血清学阳性提示密切接触人群有较高患病风险。然而，Richardus等[20]检测随访期间25例患麻风及199名未患麻风的接触者的抗PGL-1抗体水平，结果提示两组间抗体水平无显著性差异。此外，麻风患者接触者患麻风前后的抗PGL-1抗体水平无显著性差异，因此，PGL-1血清学试验并不能准确预测麻风患者接触者的发病。

2 细胞因子

2.1 Th细胞亚群相关细胞因子 麻风感染相关细胞因子主要为白细胞介素(IL)、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(TGF)，参与麻风免疫病理机制。麻风相关细胞因子的表达由辅助性T细胞介导，包括Th1、Th2、Treg、Th17、Th9等。IFN-γ主要由Th1细胞表达，在结核型麻风患者中占主导。一项纳入了38例MB及23例PB麻风患者的研究中，PB患者外周血中IFN-γ阳性应答率高于MB患者，推断IFN-γ可用于鉴别PB和MB[10]。Th2细胞诱导产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及TGF-β等细胞因子，主要参与瘤型麻风的发病机制。Marçal等[21]纳入19例患者诱导其外周血单核细胞(PBMC)分化并检测分泌IFN-γ、IL-4及IL-10的细胞亚群数。在MB患者中，Th细胞主要为介导IL-10及IL-4产生的Th2细胞亚群，而IFN-γ表达微弱。调节性T细胞(Treg)分泌TGF-β及IL-10。Treg可通过介导TGF-β表达下调T细胞反应导致瘤型麻风的免疫应答无能。与结核型麻风(TT)患者相比，瘤型麻风(LL)患者皮损及PBMC中TGF-β及IL-10表达水平升高。此外，瘤型麻风患者中体外诱导产生的Treg细胞数较结核型麻风患者高。此前研究发现Th17细胞亦参与麻风感染[22]。IL-17由Th17分泌，在瘤型麻风患者皮损中高表达。Santos等[23]纳入28例MB及PB患者检测其皮损、血清中IL-17A表达水平，并用流式细胞术分析表达IL-17A的细胞表型，发现TT患者皮损中表达IL-17A的CD4+T细胞多于LL患者，PB患者血清中的IL-17A浓度较MB患者高。

2.2 细胞因子检测的临床应用 与血清学试验相似，因其差异性表达，细胞因子检测亦可应用于麻风分型、预测麻风反应、监测疗效及家庭内接触者。

2.2.1 麻风分型及预测麻风反应 不同的Th细胞亚群共同参与麻风的免疫病理机制，决定了麻风感染的临床表型。一项综合分析多个细胞因子表达的研究中，Azevedo等[24]用实时定量聚合酶链式反应(qPCR)检测87例麻风患者皮损Th1、Th2、Th17及Tregs谱相关细胞因子表达，ELISA检测其在血清中表达水平。Th1相关靶标(mRNA)在结核样型和界限类偏结核型麻风患者中占主导，而Th2和Tregs靶向物在瘤型和界限类偏瘤型麻风患者中占主导。麻风患者血清中IL-22、IL-6、IL-10表达较对照组高，LL中的IL-10较高。RR中，Treg相关细胞因子表达水平下降，而IL-15增加。ENL中，IL-17F及IL-8表达增加。亦有研究发现伴神经痛的麻风神经病变患者中IL-1β、TNF、TGF-β和IL-17水平较高，IL-1β水平是与麻风神经病变患者合并神经痛相关的独立变量，可成为随访的重要生物标记物[25]。

2.2.2 监测疗效 Cassirer-Costa等[26]用微量样本多指标流式蛋白定量技术(CBA)检测10例结核型麻风及14例瘤型麻风患者联合化疗前后血液中IL-1β、IL-8、TNF、IL-12p70、IFN-γ、IL-17A、IL-13及IL-10水平。其中，瘤型麻风患者治疗前炎性细胞因子表达水平较高，而结核样型麻风患者治疗前炎症细胞因子及调节性细胞因子维持平衡。细胞因子网络证实，联合化疗改变了麻风患者尤其是结核样型麻风患者血清细胞因子的分布特征，瘤型麻风患者细胞因子体系特征为炎症/调节分子的强连接轴。因此，细胞因子可作为评估联合化疗效果的生物标记物。Negera等[27]纳入30例ENL患者比较激素治疗前后炎症细胞因子及调节性细胞因子的表达。治疗前的ENL患者TNF、IFN-γ、IL-1β及IL-17A水平显著增高。IL-10在治疗前显著降低，而在治疗后显著升高。ENL患者TNF、IFN-γ、IL-1β及IL-17A、IL-6的mRNA表达治疗后显著降低。而皮损及血清中的IL-10及TGF-β的mRNA表达水平在治疗后均显著降低。该研究表明，激素可通过直接或间接抑制炎症细胞因子表达相关的免疫细胞调节促炎细胞因子的产生。

2.2.3 监测HHCs Queiroz等[28]纳入18例PB麻风患者、58例MB麻风患者及112名家庭接触者，检测其外周血中的细胞因子和趋化因子，发现随访期间趋化因子2(CCL-2)在HHCs及PB麻风患者中表达较高。此外，CCL-2及IFN-γ呈负相关。因此，CCL-2及IFN-γ可能成为识别HHC亚临床感染的潜在生物标记物。

3 microRNA

3.1 microRNA参与麻风发病机制 microRNAs(miRNAs)是非编码RNA，部分miRNAs仅在麻风中表达，从转录层面调节免疫反应，在麻风发病机制中发挥重要作用[29,30]。Salgado等[30]通过比较28例麻风患者miRNAs在皮损及血液中的差异化表达发现miRNAs标记物参与调节结核样型麻风患者中的防御性免疫反应及瘤型麻风患者中的免疫抑制性反应。此外，miRNA在麻风感染中免疫系统调控、细胞凋亡、施旺细胞脱髓鞘、上皮-间充质转化及神经痛中发挥作用。Liu等[29]发现13种miRNAs在瘤型麻风及结核样型麻风患者中表达存在差异。其中，瘤型麻风患者皮损中差异最显著的hsa-mir-21在麻风菌刺激的单核巨噬细胞中表达上调。其通过直接下调Toll样受体2/1(TLR2/1)介导的25-羟基维生素D-1α-羟化酶(CYP27B1)及IL-1B表达及间接下调IL-10抑制VitD依赖的抗菌肽CAMP及DEFB4AmRNA的表达。

3.2 microRNA临床应用 与血清学抗体、细胞因子不同，microRNA在麻风临床应用较少，仅有少量研究表明部分microRNA可应用于麻风诊断及分型。Soares等[31]发现miRNA-21在麻风及麻风反应患者中表达上调。与结核样型麻风和RR麻风患者相比，瘤型麻风和ENL麻风患者中miRNA-21表达水平更高，但差异无统计学意义。推测microRNA有可能用于区分瘤型及结核样型麻风，但尚需进一步验证。Jorge等[32]用TaqMan低密度阵列方法(TLDA)分析瘤型麻风患者、结核型麻风患者及健康对照组的377种microRNAs的表达水平，随后用qRT-PCR验证16种差异表达的miRNAs，发现联合4种miRNAs检测，包括miR-101、miR-196b、miR-27b及miR-29c可进行麻风诊断，其敏感性及特异性分别为80%、91%。此外，其亦可用于区分瘤型麻风及结核样型麻风患者，敏感性及特异性为83%及80%。即使单个microRNA并不具有诊断价值，若联合其它microRNA标记物亦可用于麻风诊断及分型，但目前关于验证microRNA诊断潜能的相关研究较少，其敏感性及特异性尚需进一步验证。此外，目前尚未有研究探讨microRNA在疗效评估、HHC监测中的应用，其它非编码RNA如lncRNA、piRNA在麻风中的表达水平、麻风发病机制中发挥的作用仍有待探究。因此，未来研究需聚焦于microRNA在麻风中的临床应用，除microRNA外其它非编码RNA在麻风中的表达和作用。

4 结语

综上所述，血清学检测、细胞因子及microRNA标记物均可应用于辅助麻风的早期诊断，同时有助于不同型别麻风的区分、预测麻风反应、评估疗效及监测HHCs。但重组抗原如NDO-LID血清学试验敏感性及特异性有待提高，细胞因子相关诊断性方法的敏感性及特异性研究较少。因此，未来需挖掘更多麻风特异性抗原、更多特异性细胞因子进行麻风诊断、某种或某些稳定表达的miRNA，以及其他非编码RNA在皮损组织乃至血液中的试验应用，以期寻找操作性强、普及性广、敏感性和特异性较高的麻风免疫诊断标志物。