复合茶树接穗与接穗母本的代谢物差异分析

周泳臣，刘 颖，郑文忠，高 峻*，孔 胜，吕才有

(1 云南农业大学 茶学院，昆明 650201；2 云南省现代农业茶叶产业体系建设栽培研究室，昆明 650201；3 云南省普洱市茶叶科学研究所，云南普洱 665000)

嫁接[1]是园林园艺中一种重要的技术手段，广泛应用于果树[2]、蔬菜[3]、花卉[4]等的繁殖与良种推广，在中国已经有3000多年的历史。嫁接是指将一棵植物的器官与另一棵植物相结合，形成愈伤组织并长成一棵两者结合的植株[5]。嫁接技术在茶树中主要应用于老茶园的换种改造[6-8]、茶苗的扩繁[9]、良种的保存[10]等。叶美凤等[11]在茶树嫁接的基础上，提出了复合茶树的概念，复合茶树是指通过嫁接的方式形成一棵茶树中包含两种或两种以上的茶树品种(或包含砧木枝条在内)。由于复合茶树拥有多个不同的茶叶品种，当其中一个品种不适应其生长环境时，可及时进行剪除，防止争夺水分和养分，同时也不会影响其他茶树品种的生长，对解决现有茶园采用嫁接换种中存在的因为性状变异产生的负面影响有校正作用，对种质资源的保存、良种的扩繁以及新品种的选育具有积极作用，能够快速稳定茶园面积，同时为开发茶叶新产品提供多种鲜叶原料。

代谢组学技术是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后的又一新兴学科，根据研究目的不同，可分为靶向代谢组学和非靶向代谢组学[12]，目前的研究范围覆盖细胞代谢组学[13]、药物代谢组学[14]、植物代谢组学[15]等领域。代谢组学研究是指分析生物样品中的代谢产物，并鉴定和筛选出具有研究价值的显著差异代谢物，最后解释这些差异物的代谢过程和机制。在茶叶中，代谢组学技术广泛应用于茶树栽培、品种分类鉴别、茶叶加工工艺优化、茶叶品质控制、茶叶年份及品质鉴别等[16]方面，对茶园土壤管理、茶树育种改良、提高茶树抗逆性和嫁接砧穗的选择等有着积极的作用。

迄今，嫁接技术应用于茶树以及代谢组学应用于茶学已经有很多的研究，但是有关嫁接茶树与代谢组的结合研究却很少有文献提及。茶树嫁接后接穗与接穗母本相比具体发生了哪些代谢物的变化等也鲜有研究。‘云瑰’和‘福云6号’是云南省普洱市茶叶科学研究所实验人员通过群体选育方式获得的两个当地普洱茶优良品种，它们对环境有着较强的适应性，经济效益和生态效益较高，适合推广，其所具备的特点在普洱茶树品种中具有一定的代表性；而‘短节白毫’由云南省普洱市茶叶科学研究所实验人员通过单株无性繁殖育成，作为砧木有着较强的适应性和抗逆性。鉴于此，本研究以‘云瑰’和‘福云6号’为接穗，均以‘短节白毫’为砧木所形成的嫁接复合茶树为研究对象，利用代谢组学技术统计分析两个普洱茶品种嫁接前(接穗母本)与嫁接后(嫁接苗的接穗)的差异代谢物和共同代谢物的种类和数量，差异代谢物中表现为上调与下调的数量，以及差异代谢物存在的代谢通路，并对差异代谢物富集显著的通路进行重点分析，从理论上解释是否可以通过嫁接的方式改善茶叶的品质，在未来是否可以将生产实际中表现良好的不同茶树品种集中到一起，增加选择的可能性，并找到可实现这一目的组合，从而增加产品的多样性，为茶叶生产实践提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1 茶树嫁接及培育

普洱市位于云南西南部，地形复杂，立体气候明显，属于亚热带湿润气候，月平均气温在18～25 ℃之间，年均降水量在1 500 mm左右，光热条件良好，积温较高，适宜茶树的生长。

茶树接穗品种‘云瑰’为无性系，株型较大，分枝角度大，冠底多分枝，叶片斜状向生生长，叶形大致为椭圆形，叶色深绿，叶整体向内弯曲，叶尖呈渐尖状，叶齿深而明显，叶背茸毛密集，芽肥壮。春茶一芽二叶蒸青样含茶多酚34.10%、儿茶素190.27 mg/g、咖啡碱4.25%、水浸出物48.61%。该品种抗逆性强，生熟地适栽性较好。

茶树接穗品种‘福云6号’为小乔木大叶型，树姿半开张，树冠分枝较多，属早芽种，含水浸出物36.88%、茶多酚25.95%、氨基酸总量2.28%、咖啡碱3.43%、儿茶素总量151.24 mg/g，可用于制作红茶和绿茶，用于制作绿茶时，其毛尖茶翠绿、条索紧密、白毫较多、香气较好、汤色鲜绿透亮、滋味爽口。

茶树砧木品种‘短节白毫’为无性系，株型高大，属大叶类、中生种，树姿挺拔，枝层间距小；叶片上斜着生，叶色墨绿，芽粗短较扁，茸毛长而密。叶卵圆形，叶尖较饨，叶面向上凸起，叶质软厚；持嫩性较强；春茶一芽二叶含氨基酸2.25%，茶多酚36.41%，儿茶素16.4%，咖啡碱4.9%，水浸出物43.58%。

普洱市茶叶科学研究所实验人员于2018年1月15日开始进行对茶树的嫁接管理工作，其中以遗传信息一致的‘短节白毫’无性系为共同嫁接砧木，以优良茶树品种‘云瑰’(YG)和‘福云6号’(FY)为接穗，两个品种接穗嫁接于同一砧木的不同枝条上，并获得成活的嫁接复合茶树。本试验于2020年9月27日采集供试植物材料，主要包括接穗母本和嫁接复合茶树上的接穗。

1.2 茶树农艺性状调查

两个茶树品种嫁接前和嫁接后各随机选取30个样品(共120个样品)进行茶叶农艺学性状的测定，求取其平均值。采用20 cm直尺测定叶长、叶宽、茶芽长度和节间长度，用游标卡尺测量叶片厚度，所有样品均测量的是茶芽净长，节间测量部位为第一节灰梗，叶长、叶宽及叶片厚度测量均为成熟、健康的叶片，叶面积=0.7×叶长×叶宽。

1.3 茶叶代谢产物组分及其含量测定

1.3.1 样品采集分别采集嫁接复合茶树上两个品种的接穗(嫁接后，YGA和FYA)以及各自接穗母本(嫁接前，YGB和FYB)枝条上的一芽二叶嫩芽共计4个样品作为测定样品，每个样品有3个重复，采后立即用液氮冷冻保存在-80 ℃的环境中进后续实验。

1.3.2 标准品与试剂参试的试剂包括甲醇(色谱纯，Merck品牌)、乙腈(色谱纯，Merck品牌)和标准品(色谱纯，BioBioPha/Sigma-Aldrich品牌)。

1.3.3 代谢产物提取(1)生物样品放置于冻干机(Scientz-100F)中真空冷冻干燥；(2)利用研磨仪(MM 400，Retsch)研磨(30 Hz，1.5 min)至粉末状；(3)称取100 mg的粉末，溶解于1.2 mL 70% 甲醇提取液中；(4)每30 min涡旋一次，每次30 s，共涡旋6次，样品置于4 ℃冰箱过夜；(5)离心(转速12 000 r/min，10 min)后，吸取上清，用微孔滤膜(0.22 μm pore size)过滤样品，并保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS 分析。

1.3.4 代谢产物组分色谱、质谱分析本研究利用超高效液相色谱(UPLC)和串联质谱(MS/MS)对数据进行采集。(1)色谱条件：色谱柱：Agilent SB-C181.8 μm，2.1 mm×100 mm；流动相A：超纯水(加入0.1%的甲酸)；流动相B：乙腈(加入0.1%的甲酸)；洗脱梯度：0～9 min，B相比例由5%线性增加至95%；9～10 min，B相比例持续95%；10～11 min，B相比例由95%骤降至5%；11～14 min，B相比例一直保持在5%；流速0.35 mL/min；柱温40 ℃；进样量4 μL。(2)质谱条件：线性离子阱(LIT)和三重四极杆(QQQ)扫描是在三重四极杆线性离子阱质谱仪(Q TRAP)，AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS 系统上获得的，该系统配备了ESI Turbo离子喷雾接口，可由Analyst 1.6.3软件(AB Sciex)控制运行正负两种离子模式。ESI源操作参数如下：离子源，涡轮喷雾；源温度550 ℃；离子喷雾电压(IS)5 500 V(正离子模式)/-4 500 V(负离子模式)；离子源气体 Ⅰ(GSⅠ)、气体 Ⅱ(GS Ⅱ)和帘气(CUR)分别设置为50、60和25.0 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。在QQQ和LIT模式下分别用10和100 μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。QQQ扫描使用MRM模式，并将碰撞气体(氮气)设置为中等。通过进一步的DP和CE优化，完成了各个MRM离子对的DP和CE。根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测一组特定的MRM离子对。

1.3.5 代谢物定性、定量分析利用数据库MWDB(metware database)，使用二级谱信息对化合物定性，在分析时过滤掉同位素信息，其中包括K+离子、Na+离子、NH4+离子的重叠信息，还有本身为其他更大分子量化合物的碎片分子的重叠信息。同时，本研究采用了三重四级杆质谱的多反应监测模式(MRM)对代谢物进行定量分析。MRM模式中，四级杆先检测目标物的前体分子(母离子)，再剔除掉与其他分子量物质对应的分子以初步排除干扰；而前体分子在经碰撞室的诱导电离后断裂产生了很多碎片离子，碎片离子再通过三重四级杆过滤选择出所需要的一个特征碎片离子，排除非目标离子干扰，使定量更为精准，获得更好的重复性。最后将得到的各个样品的代谢物质谱分析数据进行所有质谱峰的峰面积积分，并完成质谱峰的校正。

1.3.6 代谢物的鉴定及差异代谢物筛选基于MWDB数据库，对样本的代谢物进行质谱定性定量分析；基于OPLS-DA结果，从获得的多变量分析OPLS-DA模型的变量重要性投影(VIP)，筛选出各样本的差异代谢物。同时可以结合单变量分析的差异倍数值(fold change)或者p-value来最终按照fold change≥2或fold change≤0.5且VIP≥1的标准筛选差异代谢物。

1.3.7 差异代谢物KEGG功能注释及富集分析将代谢物注释KEGG数据库，统计每个KEGG通路包含的差异代谢物的数量并进行统计分析，绘制成柱形图。

2 结果与分析

2.1 嫁接对茶树品种茶叶农艺学性状的影响

茶树品种‘云瑰’和‘福云6号’嫁接前后的茶叶农艺学性状测定结果显示，嫁接后的复合茶树接穗YGA和FYA茶芽生长均比嫁接前接穗母本(YGB和FYB)显示出了一定的嫁接优势，其叶面积、叶片厚度、茶芽长度和节间长度都比嫁接前的相应茶树品种有所增加(图1，表1)，这些农艺性状的改变会对茶叶品质有着一定的提升作用。

图1 两个茶树品种嫁接后与嫁接前的茶芽对比

表1 各茶叶样品的农艺性状

2.2 嫁接对茶叶代谢物组分的影响

2.2.1 代谢物质谱检测稳定性分析质控样本(QC)由样本提取物混合制备而成，用于分析样本在相同的处理方法下的重复性。在仪器分析的过程中，每10个检测分析样本中插入一个质控样本，以监测分析过程的重复性。QC样本质谱检测正负离子模式的TIC重叠图(图2，A、B)显示，质控样本(QC)TIC重叠图中曲线的重叠性高，无干扰信号，仪器具有较高的稳定性，检测结果可靠。

图2 负离子模式(A)和正离子模式(B)QC样品质谱检测TIC重叠图

‘云瑰’茶叶样品YGA和YGB共检测和定量了805个代谢物，‘福云6号’茶叶样品FYA和FYB共检测和定量了817个代谢物；这些代谢物共分为11个大类，包括黄酮类、酚酸类、脂质、氨基酸及其衍生物、其他类、有机酸、核苷酸及其衍生物、生物碱、鞣质、木脂素和香豆素、萜类，具体代谢物的分类及数量详见表2。

表2 样品YGA和YGB、FYA和FYB代谢物分类及数量

2.2.2 主成分分析(PCA) 从各组合的总体表现(图3)来看，在总体PCA的二维图中，‘云瑰’茶叶样品YGA和YGB代谢物成分相互之间完全分离，而‘福云6号’样品FYA和FYB的代谢物成分却不完全分离，说明品种‘福云6号’对应的接穗与接穗母本样品代谢物的组成成分差异相对于品种‘云瑰’来说较小。

图3 各组样品的PCA得分图

2.2.3 OPLS-DA分析利用OPLS-DA(图4，Ⅰ、Ⅲ)分析所得的数据，制出各样品的得分图，可以更加清晰地表示各样品的代谢物差异；OPLS-DA S-plot(图4，Ⅱ、Ⅳ)能直观地展示每个代谢物的贡献率，它可以比较直观地呈现出样品间的显著差异代谢物，代谢物在模型中各组样品分类鉴定中的影响强度用VIP值表示，红色的点代表差异显著代谢物(VIP≥1)，绿色的点代表差异不显著的代谢物(VIP值小于1)。如图4所示，茶叶样品YGA与YGB、FYA与FYB完全分离开来，说明OPLS-DA可以很好地区分样品YGA与YGB、FYA与FYB(图4，Ⅰ、Ⅲ)，并且通过OPLS-DA S-plot图能够直观看出样品YGA与YGB、FYA与FYB的差异代谢物及差异不明显的代谢物(图4，Ⅱ、Ⅳ)。

图4 茶叶样品YGA和YGB(Ⅰ、Ⅱ)、FYA和FYB(Ⅲ、Ⅳ)的OPLS-DA得分图和OPLS-Slopt图

2.2.4 差异代谢物的筛选鉴定与分析鉴于本研究结果具有生物学重复，故选择FC和VIP值相结合的方法来选取差异代谢物，并要求同时符合FC≥2或FC≤0.5和VIP≥1两个要求。

火山图(图5，Ⅰ、Ⅲ)上能够很直接地看到各样品的代谢物差异，图中的点均有与其一一对应的代谢物；聚类结果表明，差异代谢物在同一样品的不同重复间表达量相似，样品重复性较好，而在嫁接前后对比中的表达量存在较大差异，说明嫁接后样品的差异代谢物发生了较大的改变(图5，Ⅱ、Ⅳ)。其中，‘云瑰’样品YGA和YGB茶叶中共检测和定量了805种代谢物，与YGB相比，YGA的代谢产物中有115种(14.3%)显著变化的代谢物，其中52种差异代谢物的丰度显著增加，而63种差异代谢物的丰度显著降低(图5，Ⅰ)；这些差异代谢物按照数量的多少通常可以分为黄酮类、酚酸类、有机酸、脂质、氨基酸及其衍生物、鞣质、其他类、核苷酸及其衍生物、木脂素与香豆素以及生物碱(图5，Ⅱ；表3)。同时，‘福云6号’样品FYA和FYB茶叶中共检测和定量了817种代谢物，与FYB相比，FYA的代谢产物中有47种(0.06%)显著变化的代谢物，其中29种差异代谢物的丰度显著增加，而18种差异代谢物的丰度显著降低(图5，Ⅲ)；这些差异代谢物按照数量的多少可以分为黄酮、脂质、酚酸类、核苷酸及其衍生物、鞣质、氨基酸及其衍生物、生物碱、有机酸、木脂素和香豆素(图5，Ⅳ；表3)。另外，进一步比较两个组合差异代谢物之间的关系可知，‘云瑰’样品YGA和YGB特有108个差异代谢物，‘福云6号’样品FYA和FYB特有40个差异代谢物，样品YGA和YGB与样品FYA和FYB共有7个差异代谢物(图6)。

火山图(Ⅰ、Ⅲ)中绿色点为下调的差异代谢物，红色点为上调的差异代谢物，灰色点为变化不明显的代谢物；聚类热图(Ⅱ、Ⅳ)中横向为样品名称，纵向为代谢物信息，不同颜色为相对含量标准化处理后得到的数值

表3 样品YGA和YGB、FYA和FYB差异代谢物

图6 各组样品的差异代谢物韦恩图

2.2.5 各样品茶叶代谢物总体的代谢通路分析差异代谢物在生物体内相互作用，形成了不同的通路。其中，样品YGA和YGB的KEGG差异代谢物分类图(图7，Ⅰ)显示，嫁接前后的‘云瑰’茶叶样品差异代谢物在38条KEGG通路中富集，大多数已经鉴定的差异代谢物存在于与苯丙氨酸代谢、类黄酮的生物合成、黄酮及黄酮醇的生物合成、精氨酸和脯氨酸的代谢等相关途径中。同时，对样品FYA和FYB的路径分析(图7，Ⅱ)表明，嫁接前后的‘福云6号’茶叶样品差异代谢物在21条KEGG通路中富集，大多数已经鉴定的差异代谢物存在于与嘌呤代谢等相关的途径中。两个茶树品种嫁接前后差异代谢物的KEGG代谢通路分析结果显示，代谢通路类别所鉴定的差异代谢物最多，表明茶树嫁接过程中接穗‘云瑰’和‘福云6号’有较强的代谢活动。

图7 样品YGA和YGB(Ⅰ)、FYA和FYB(Ⅱ)的KEGG差异代谢物分类图

3 讨 论

本研究通过对茶树嫁接前后的茶芽农艺性状表型观察发现，嫁接后接穗茶芽生长表现出的嫁接优势，与一些研究中发现的某些现象一致[17-18]。而且经观察发现，嫁接可以促进茶芽的萌发和产量的提高。有大量的理论研究和生产实践证明，接穗和砧木嫁接后，可以提高植物的产量、抗逆性以及改良果实的品质等[19]，使其表型、生理生化特性以及基因表达有所改变[20]。

本次对嫁接茶树的接穗与接穗母本进行的代谢组研究中，补充了前人对于嫁接茶树的研究，检测到了嫁接茶树接穗与接穗母本之间的差异代谢物，同时也发现其中黄酮类、酚酸类、有机酸、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、鞣质、脂质、生物碱、木脂素和香豆素等物质的相对含量变化较大，嫁接茶树接穗与接穗母本之间差异显著，且差异代谢物主要集中在类黄酮的生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成、嘌呤的代谢、咖啡碱的代谢、苯丙氨酸的代谢、精氨酸和脯氨酸的代谢等途径中。在嫁接茶树接穗与接穗母本中能够检测到差异代谢物，这与齐丹丹等[21]“改换根系有可能影响接穗部分次生代谢产物的组成和含量，从而影响茶叶的品质”的研究结果一致。

两个接穗品种‘云瑰’和‘福云6号’间相比较，它们嫁接茶树接穗与相应接穗母本茶叶中均检测到了不同种类不同数量的差异代谢物，而差异代谢物的种类和数量最多的是品种‘云瑰’，品种‘福云6号’次之，而且‘福云6号’的差异代谢物的代谢通路也较少一些。结合各组合的PCA分析结果分析其原因，可能是‘福云6号’与砧木‘短节白毫’的亲和力要强，适应性要好，以‘福云6号’作为接穗进行嫁接，能更大程度上保持接穗的特点。

在嫁接茶树接穗与接穗母本间相比较，‘云瑰’接穗及其接穗母本之间共有115个差异代谢物，表现上调的差异代谢物的数量低于表现下调的，说明品种‘云瑰’接穗与接穗母本相比，相对含量增加的代谢物的种类与数量较多。据前文对差异代谢物的分析，差异代谢物的数量和种类变化最大的是黄酮类物质，接穗与接穗母本相比，拥有较多的酚酸类、氨基酸及其衍生物、鞣质、生物碱，其中的鞣质和生物碱只有增加；接穗母本与接穗相比，拥有较多的黄酮类、有机酸、脂质；数量保持不变的为糖及醇类、核苷酸及其衍生物以及木脂素和香豆素。这表明对于品种‘云瑰’来说，通过嫁接的方式，接穗茶芽中酚酸类、氨基酸及其衍生物、鞣质、生物碱的含量会减少，其黄酮类、有机酸、脂质的含量会增加，而其糖及醇类、核苷酸及其衍生物、木脂素和香豆素的含量可能会保持不变。黄酮类的增加可改善茶叶的滋味，氨基酸的减少会影响茶叶的鲜爽味。Thomas[22]研究发现，苯丙酮酸参与芳香族香气的合成，酮酸不仅本身有香气，还参与芳香族香气的合成。结合前文对苯丙氨酸代谢途径的分析，苯丙酮酸的相对含量的减少会使茶叶的香气有一定程度的降低。黄华林等[23]提到了芦丁具有增强苦味的作用，结合前文对黄酮即黄酮醇的生物合成途径的分析，芦丁相对含量的增加可改善茶叶滋味。总之，综合以上对茶叶滋味和香气的分析，茶树品种‘云瑰’作为接穗嫁接后，茶滋味会有所改善，香气会有一定程度的降低。具体的香气和滋味的变化要等制成干茶样品后，并结合生化成分含量的测定与感官审评进行进一步研究。

同时，茶树品种‘福云6号’接穗与其接穗母本茶芽中共有47个差异代谢物，表现上调的差异代谢物的数量高于表现下调的，说明品种‘福云6号’接穗与其接穗母本相比，相对含量增加的代谢物的数量与种类较多。根据前文对该组合差异代谢物的分析，差异代谢物的数量和种类变化最大的是黄酮类物质和脂质，接穗与接穗母本相比拥有较多的黄酮类、脂质、酚酸类、核苷酸及其衍生物、鞣质、木脂素和香豆素，其中的鞣质和木脂素及其香豆素只有增加；接穗母本与接穗相比，拥有较多的氨基酸及其衍生物、生物碱，其中氨基酸及其衍生物是接穗相比于接穗母本只有减少；数量保持不变的代谢物为糖及醇类、核苷酸及其衍生物以及木脂素和香豆素。这表明对于品种‘福云6号’来说，通过嫁接的方式，接穗茶芽中黄酮类、脂质、酚酸类、核苷酸及其衍生物、鞣质、木脂素和香豆素的含量会减少，而其氨基酸及其衍生物、生物碱的含量会增加，但其有机酸的含量可能会保持不变。推测黄酮类代谢物的减少会使茶叶的滋味变淡，氨基酸的增加会促进茶叶的鲜爽味，脂质含量的降低会影响茶叶的香气。综合以上对茶叶滋味和香气的分析，品种‘福云6号’接穗茶叶的滋味变淡，鲜爽味可能会增加，香气可能会有所降低。茶叶具体的香气和滋味的变化要等制成干茶样品后，并结合生化成分含量的测定与感官审评进行进一步研究。