抗疫病加工型辣椒细胞质雄性不育恢复系的创制

李怡斐，杨小苗，王春萍，段敏杰，黄任中，张世才*

(1 重庆市农业科学院蔬菜花卉研究所，重庆 401329；2 重庆市农业科学院生物技术研究所，逆境农业研究重庆市市级重点实验室，重庆 401329)

辣椒(CapsicumannuumL.)是世界上广泛种植的一种作物，可作为蔬菜、香料、食用色素和医药用途。2020年全球辣椒种植面积达161.5万hm2，产量达415.7万t(http://www.fao.org/faostat/zh/#data/QC)。在过去的30年里，朝天椒消费量增长了40倍[1]。目前辣椒杂交种生产主要依靠人工去雄和授粉，不仅生产成本高，种子纯度也难以保障。CMS三系杂交制种具有节约去雄成本、保证杂交种纯度、制种产量高和保护品种知识产权等优点。

近年来，国内外学者致力于辣椒CMS恢复系分子标记辅助育种研究，已基于RAPD、AFLP和序列同源性开发了几个可以预测恢复基因Rf表型的分子标记[2-6]。Gulyas等[7]将RAPD标记OPT-02/570转成与Rf紧密连锁的CRF-SCAR标记，遗传距离为5.3 cM。Kim等[3]将AFRF8转化为CAPS标记AFRF8CAPS，遗传距离为1.8 cM。Lee等[5]确定了与CMS育性恢复相关的部分恢复(pr)位点，开发了与该位点密切连锁的CAPS标记(PR-CAPS)(距Rf1.8 cM)。与Rf紧密连锁的分子标记可有效提高筛选CMS恢复系的效率，在苗期即可取叶片进行PCR鉴定，不受季节的影响。

目前，由辣椒疫霉(phytophthoracapsici)引起的疫病已成为国内外辣椒主产区最具破坏性的病害之一，每年造成超过1亿美元的经济损失[8]。在强降雨、过度灌溉、排水不畅等条件下更容易引起辣椒疫病发生[9-10]。迄今为止，除化学防治外尚未有有效和安全的措施防治疫病[11-13]。因此，利用抗病品种已成为解决辣椒疫病发生的简单、有效、安全的途径。植物育种家也把重点放在培育高抗性品种上。Quirin等[14]开发了一个与辣椒疫病紧密连锁的SCAR分子标记FQ01/RQ01。李怡斐等[15]利用SLAF-seq构建了辣椒高密度遗传图谱，该图谱包含12个连锁群，5 565个标记，并对疫病抗性进行了QTL定位。这些为分子标记的开发以及利用MAS培育抗病品种提供了技术支撑。

当前，花药培养技术可以更快速、更节约地创制性状纯合的育种(纯)系，大大减少创制育种纯系所需的世代数，从而降低育种工作的成本[16]。近年来，国内外科研工作者通过花药培养技术获得了一批DH系。Cabuk等[17]以辣椒Clrgalan和P1(抗疫病)BC2F2为供试亲本进行辣椒花药培养，结合分子标记辅助选择获得25个抗疫病的辣椒纯系。李怡斐等[18]采用花药培养技术与MAS技术相结合的方法创制了3个性状优良的加工型辣椒CMS恢复系。随后，李怡斐等[19]利用花药培养技术与MAS相结合的方法创制了14个抗疫病双单倍体(doubled haploid，DH)株系。重庆位于中国西南地区，夏季高温多雨天气容易诱发辣椒疫病大面积爆发，为了更好地解决制种纯度和辣椒疫病问题，培育抗疫病的CMS恢复系就成为是解决该问题的唯一方法。

本研究为创制抗疫病加工型辣椒CMS恢复系材料，以长果、单生朝天椒作母本，以抗疫病恢复系为父本，利用杂交、花药培养和MAS相结合的方法，开展抗疫病CMS恢复系的创制，以期获得单生、长果的抗疫病CMS恢复系，为利用三系配套选育加工型辣椒抗病新品种奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本课题组选用抗疫病恢复系939-1和1021(1)-1为抗疫病和恢复基因供体亲本，以长果、单生自交系481-4-10作为受体亲本，配制杂交组合。

1.2 方 法

1.2.1 花药培养2017年5～7月在重庆市农业科学院生物技术研究所以(481-4-10×939-1)F1和[481-4-10×1021(1)-1]F1为供体亲本进行花药培养。上午9点前摘取处于单核靠边期的花蕾置于冰盒中带回实验室。在超净工作台上用70%酒精表面消毒30 s，随后用0.1% HgCl2消毒7 min，无菌水漂洗4次，之后将花蕾置于装有无菌滤纸的培养皿中。无菌条件下将花药接种于胚状体诱导培养基(MS+0.5 mg/L BA+0.5 mg/L 2,4-D+3%蔗糖+7 g/L琼脂+4 mg/L AgNO3+0.04%活性炭)，9 mm×9 mm培养皿接6个花蕾的花药，35 ℃高温预处理5 d[20]。

1.2.2 再生植株倍性鉴定以 939-1 正常二倍体为对照，分别取对照和花培再生植株的新鲜嫩叶1～2 片，标记后送北京红山风尚科技有限公司进行倍性检测。倍性检测的仪器为Partec公司的CyFlow Space，所用试剂为 Partec CyStain UV Precise P 快速倍性分析试剂盒。取0.5 cm2的新鲜叶片，置于培养皿中，加入400 μL 核酸提取缓冲液(Nuclear Extraction Buffer)，用锋利刀片切碎，放置10 s，再用30μm滤网将样本过滤至样品管中，加入 600 μL 染色缓冲液(Staining Buffer)，轻微混匀，即可上机测试。

1.2.3 分子标记辅助选择鉴定采用Gulyas等[7]开发的CRF-SCAR标记鉴定辣椒花培DH系是否携带Rf基因， CRF-SCAR引物序列为F(5′-ATT-TTCAGATTGTGGCGACG-3′)和R(5′-CGACC-ATCACGACGAGG-3′)。利用Quirin等[14]开发的与辣椒抗疫病QTL位点Phyto.5.2.紧密连锁的FQ01/ RQ01标记鉴定辣椒DH系的疫病抗性。引物为FQ01(5′-CCATAAGGGTTGGTAAATTTA-CAAAG-3′)和RQ01(5′-TCGAGAGATAATTC-AGATAGTATAATC-3′)，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

本研究采用CTAB法提取辣椒叶片DNA。反应体系为20 μL，基因组DNA 1 μL，2×PCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，灭菌水20 μL。PCR反应程序为94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32个循环；72 ℃ 1 min。

1.2.4 苗期抗性鉴定采用灌根接种法鉴定辣椒花培DH系的疫病抗性，参照NY/T2060.1-2011《辣椒抗病性鉴定技术规程-辣椒抗疫病鉴定技术规程》。在幼苗6叶展平期进行，接种前浇透水，用手术刀在距离幼苗根部3 cm处断根，用移液器吸取5 mL游离孢子浓度为1×105个/mL孢子悬浮液注入辣椒幼苗根部附近。接种后将植株置于白天温度25～28 ℃、夜间温度为20～22 ℃的培养室，每天光照10～12 h，使基质湿度保持近饱和状态。接种后7 d调查记载各级病株数。病情级别划分及抗性评价方法参照辣椒抗疫病鉴定技术规程的标准。

1.2.5 DH系农艺性状调查小区1.333 m×4.0 m，双行单株种植，每小区种植20株，3次重复。结果盛期进行农艺性状调查，用卷尺测量株高和冠幅，调查始花节位、果实朝向、单株结果和果形等。随后摘取辣椒红熟果实进行室内考种，包括果长、果宽和辣味等。

1.2.6 测交验证以481-4-1A和0313932A不育系分别作测交亲本(母本)，以DH系为测交父本，验证DH系对不育系的育性恢复能力。盛花期分别取DH系开放的花，分别与481-4-1A和0313932A授粉，授粉后做好标记，共授粉4次，每个DH系测交5株。调查测交后代的育性，育性记载为恢复株率。

2 结果与分析

2.1 DH系的获得

2017年春季进行辣椒花药培养，每个杂交组合接种40皿，每皿接种6枚花药，共接种240枚花药。结果表明：供体亲本(481-4-10×939-1)F1经花药培养共诱导出22个胚状体，诱导率为9.17%。其中成苗的有19个，移栽成活后经人工加倍，11个花培再生苗可正常结实，经倍性鉴定均为二倍体(图1)，即得到了11个花培DH系；[481-4-10×1021(1)-1]F1经花药培养共诱导出20个胚状体，诱导率为8.33%，其中成苗14个，移栽成活后经人工加倍，9个花培再生苗可正常结实，即获得9个DH系。

A.939-1(二倍体)；B.花培再生植株(二倍体)

2.2 分子标记辅助选择

采用分子标记CRF-SCAR鉴定花培DH系是否携带Rf基因，该标记在可育材料中可扩增出870 bp的特异条带，在不育材料中则无特异条带。PCR扩增结果表明(图2，表1)，由供体(481-4-10×939-1)F1获得的11个DH系中有7个可扩增出870 bp的特异条带，占63.6%；而来自供体[481-4-10×1021(1)-1]F1的9个DH系中有8个扩增出870 bp的特异条带，占88.9%。

M. DL2000；1～11. (481-4-10×939-1)F1获得的DH系；12～20.[481-4-10×1021(1)-1]F1获得的DH系

采用分子标记FQ01/RQ01验证花培DH系的疫病抗性，该标记在抗疫病材料可PCR扩增出717 bp大小的特异条带，感疫病材料则无特异条带。试验结果表明(图3)，供体(481-4-10×939-1)F1获得的11个DH系中有5个DH系扩增出条带大小为717 bp的特异条带，初步认为这5个DH系抗疫病，占45.5%；而供体[481-4-10×1021(1)-1]F1获得的9个DH系中有4个扩增出717 bp的特异条带，占44.4%。

M.DL2000；1～11. (481-4-10×939-1)F1获得的DH系；12～20.[481-4-10×1021(1)-1]F1获得的DH系

由此可知，通过MAS技术初步筛选到7个含Rf的抗疫病DH系，分别命名为‘渝辣选3-2’、‘渝辣选3-3’、‘渝辣选3-5’、‘渝辣选7-1’、‘渝辣选7-5’、‘渝辣选7-6’和‘渝辣选7-9’，需进一步通过苗期抗性鉴定明确其抗性。

2.3 苗期抗性鉴定

为了进一步明确花培DH系的疫病抗性，采用灌根接种法鉴定MAS技术初选的抗疫病DH系的疫病抗性，以PI201234为抗病对照，以Early calwonder为感病对照，接种辣椒疫霉菌后7 d调查病情(图4)，根据农业部辣椒抗疫病鉴定行业标准关于依据辣椒疫病病情指数划分参试品种抗病类型的标准，苗期抗性鉴定试验结果表明，7个DH系的病情指数介于18.1～36.8之间，其中5个DH系抗疫病，2个中抗疫病(表1)，说明这7个DH系较抗疫病。

A.PI201234；B.Early calwonder；C.渝辣选3-2 Yulaxuan 3-2

表1 辣椒DH系疫病抗性鉴定

2.4 农艺性状

盛果期调查携带Rf基因的7份抗疫病DH系的农艺性状(表2)，调查结果表明，各DH系的株高介于69.3～88.0 cm，以‘渝辣选7-9’株高最高；冠幅范围在71.5～78.5 cm之间，以‘渝辣选7-1’的冠幅最大；始花节位在9.0～14.3节之间，以‘渝辣选3-3’的始花节位最高；5个DH系果实均为单生向上，果形为羊角和牛角；果长介于10.3～15.1 cm，以‘渝辣选7-5’果最长；果宽范围在1.5～2.1 cm之间，以‘渝辣选7-5’果宽最大；单株结果数介于48.9～97.4个，以‘渝辣选3-2’最多，为97.4个；其中‘渝辣选3-2’和‘渝辣选7-1’味辣，其余为微辣。综上所述，其中‘渝辣选3-2’和‘渝辣选7-1’果实是单生、长果朝天椒，味辣，可作为亲本进行加工型辣椒新品种选育。

表2 辣椒DH系农艺性状调查

2.5 测交验证

2019年以481-4-1A和0313932A不育系分别作母本，以DH系‘渝辣选3-2’和‘渝辣选7-1’分别作父本，测交验证DH系的育性恢复性。将测交后代定植于国家农作物改良中心(重庆分中心)基地，调查花粉育性(表3)。各测交组合的测交株系均表现可育，各测交株系的恢复株率均为100%。表明‘渝辣选3-2’和‘渝辣选7-1’均为CMS恢复系，田间调查结果与分子标记辅助选择结果一致。

表3 测交验证DH系对CMS不育系的恢复性

3 讨 论

据报道，已在150多种植物中发现了CMS，用于简化F1杂交种子生产中繁重的去雄和人工授粉[21]。但是，目前辣椒上只有极少数品种能应用三系配套进行杂种一代生产[22-23]。主要是由于辣椒育种中CMS恢复系较少，且恢复系的选育较难，因此对于恢复系的选育研究十分重要。然而，通过传统育种技术选育CMS恢复系费时、费工，而通过花药培养与常规育种技术、分子标记辅助选择技术的有效结合，在2～3年内可以培育出聚合多种性状的DH系。目前，育种家们已经利用花药培养创制了一些优异的新种质[19,24-27]。

本研究通过常规育种和花药培养技术将抗疫病恢复系939-1和1021(1)-1的Rf基因和抗病基因导入长果、单生自交系481-4-10，用与Rf基因紧密连锁的CRF-SCAR标记检测DH系的育性恢复性，然后采用FQ01/RQ01标记检测各DH系的疫病抗性。苗期抗性鉴定进一步明确DH系的疫病抗性。最终经PCR检测与苗期抗性鉴定出5个携带Rf的抗疫病DH系。盛花期调查5个DH系的农艺性状，其中‘渝辣选3-2’和‘渝辣选7-1’综合农艺性状优良。采用测交法进一步验证2个DH系对不育系481-4-1A和0313932A的恢复性，两个不育系各测交组合的DH系测交株系的恢复株率均为100%。由此可见，将常规育种、生物技术和分子标记辅助选择技术有机结合是创制辣椒新种质的捷径，显著缩短了育种材料的纯化时间，从而加快育种进程。

利用花药培养技术快速将几个性状或基因进行聚合最关键的一个环节是MAS技术，如果已有与目标基因紧密连锁的分子标记，可通过PCR扩增快速对目标基因进行筛选。该技术已经在水稻上广泛应用，王兴春等[28]利用分子标记辅助选择与花药培养相结合快速聚合水稻白叶枯病抗性基因，获得16株携有xa5基因。宋丁丁等[25]利用花药培养和分子标记选择相结合改良了水稻稻瘟病和褐飞虱抗性。孙海波等[26]利用花药培养快速培育聚合抗3种水稻病害基因的新种质14个。本研究利用花药培养与分子标记辅助选择技术创制了2个长果、单生抗疫病兼CMS恢复的DH系，可用于培育长果朝天椒品种的选育，进而降低生产成本。说明花药培养技术与分子标记辅助选择相结合是根据育种目标而创制新种质的有效途径。

花药培养与MAS的有效结合，从供体亲本配制到分子标记鉴定、抗病性鉴定和测交验证仅用2～3年(与南繁结合)，高效培育出携带Rf基因兼抗疫病的辣椒DH系，即CMS恢复系，比常规育种快，显著提高了育种效率。随着现代生物技术的迅猛发展，与各种性状紧密连锁的分子标记不断涌现，花药培养效率不断提高，通过该方法实现性状聚合有望在育种实践中得到广泛的应用。