复方铁皮石斛对自发性高血压大鼠血压及TRPV1 mRNA表达的影响

吴悦 吴人照 薛晓敏 李毓 陈赢智 王洁 陈仕永 黄抒伟

高血压是一种以体循环动脉血压升高为主要特征，可伴有多种器官损害的心血管综合征，其中约90%无法明确病因，被称为原发性高血压（essential hypertension，EH）。中国高血压调查［1］显示我国成人高血压患病率为27.9%，据此估算，我国现患高血压人数约3亿，每年平均新增高血压患者近1,000万。降低血压对于预防高血压患者的器官损伤和降低心血管疾病死亡率至关重要。目前高血压治疗仅仅为对症治疗，随着高血压患病率不断提高以及人类寿命的增加，用药时间不断加长。近年已有研究报道长期服用如血管紧张素转换酶抑制剂一类的降压药物，可能增加患者用药后的副作用［2］。因此，如何在降压的同时减少其副作用已成为当前高血压治疗方面的研究热点及趋势。铁皮石斛属多年生草本植物，始载于《神农本草经》，具有益胃生津、滋阴清热的功效，为补阴之要药，是我国传统名贵中药材之一。铁皮石斛性微寒，现代药理学研究表明，其具有抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤、降血糖、增强免疫力等多方面药理作用［3］。已有研究提示，铁皮石斛及其提取物对高血压大鼠均有很好的降压作用［4］。近年来大量研究发现瞬时受体电位香草酸受体亚型1（transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1）在血管收缩功能调控过程中发挥重要作用，可能与高血压的病理过程有关，然而在药物开发领域，TRPV1通道的研发价值仍主要作为镇痛和抗炎药物靶点，尚未出现以其为靶点的抗高血压药物［5］。本研究拟观察复方铁皮石斛的降压效果，以及其对心肌组织中TRPV1 mRNA表达的影响，也为抗高血压药物开发提供新的靶点及思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取8月龄雌性自发性高血压大鼠（spontaneous hypertensive rats，SHR）24只，同龄雌性Wistar-Kyoto（WKY）5只：SHR大鼠体质量185~210 g，WKY大鼠体质量246~289 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006；合格证号：1100111911009832。本研究经浙江省中医药研究院实验动物伦理委员会批准（编号：KTSC2021058）。所有大鼠均饲养于浙江省中医药研究院实验动物中心（许可证号：SCXK-（浙）2019-0010），温度为（25±2）℃，相对湿度为55%~60%。大鼠采用标准颗粒饲料喂养，并保持12 h暗-光循环。大鼠适应性喂养1周后开始实验。

1.2 药物 复方铁皮石斛：采用中试生产的复方铁皮石斛咀嚼片（1.5 g/片），每1 g片剂含复方生药约0.777 g，（批号：201905002），由浙江省中医药研究院提供。复方铁皮石斛由铁皮石斛、白芍（Paeoniae Radix Alba）按4∶3比例组成，研粉添加辅料压片，目前处在创新中药临床前研究阶段，已经完成组方优化研究、提取工艺和制剂研究、中试生产、质量标准和稳定性研究、降压药效研究。目前已有质量稳定可控的中试生产药品，作为研究用样品。

1.3 试剂与仪器 本实验与本课题组其他实验共同完成，相关试剂及仪器已有文献报告［6］。

1.4 分组及给药方法 SHR大鼠随机分为复方铁皮石斛低剂量组0.7 g/（kg·d）（以下称“低剂量组”）、复方铁皮石斛中剂量组2.1 g/（kg·d）（以下称“中剂量组”）、复方铁皮石斛高剂量组3.5 g/（kg·d）（以下称“高剂量组”）、模型组，每组6只，5只WKY大鼠为正常组。各治疗组大鼠经口灌胃容量为1.84 mL·100 g-1，模型组和正常组予饮用水等容量灌胃，每日灌胃1次，连续灌胃8周。

1.5 血压测量 课题组前期研究发现，在给药后3 h各治疗组降压药效最高，在下次给药前即给药24 h药效最低，所以需要测量给药后3 h和24 h的血压，来评估降压疗效在一天中的稳定和持久性。测量血压前，将恒温水浴锅打开，温度调至38℃，水面上平铺放置一块合适的不锈钢板，将大鼠置于大小合适的空水杯中，杯底和杯盖分别留有小孔以便大鼠头部和尾巴置于外部，将装有大鼠的杯子放于恒温水浴锅上的钢板上加热，为了避免各组大鼠因个体差异而产生的过度加热影响血压，首次加热4 min，若未能获得血压数据则增加加热次数，第二次及以上加热均为2 min，并随环境温度的变化对加热时间进行调整。将加压感应器套在大鼠尾根部，加压感应器指示尖端与大鼠尾巴尖端方向保持一致，通过BP-98A型无创尾动脉血压测量仪配套软件在电脑上获取血压数据。每只大鼠每次测量6~10次血压，均值作为该鼠测量值。

1.6 实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）法检测心脏基因表达。所有大鼠麻醉处死后取心肌组织于液氮中速冻后保存于-80℃条件下，用于检测心肌组织TRPV1 mRNA的表达。使用试剂RNAisoPlus9109提取总RNA，取80~100 mg组织加液氮研磨4~5次成粉末状，加1 mL Trizol继续研磨至透明状，转移至1.5 mL离心管（Tube）中，室温（4℃~25℃）静置5 min。加入0.2 mL的三氯甲烷，充分混匀呈乳浊液，室温静置5 min；在4 ℃以12,000×g速度离心15 min。吸取400μL上清至新1.5 mL Tube中，加 600~800 μL异丙醇，混匀，室温静置10 min；12,000×g 4℃离心10 min。弃上清液，加入1 mL 75%乙醇（DEPC水配制）洗涤沉淀，室温静置3 min；在4℃以12,000×g速度离心10 min。尽量弃干净上清液，室温干燥（不可加热）5~10 min。用适量DEPC水溶解样品，测量浓度和OD260/OD280。用试剂盒 PrimeScript™ RT Master Mix（Perfect Real Time）RR036A进行逆转录。在Tube中（RNase free）配制混合液：模板RNA500ng；5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL；RNase free ddH2O Up to 10 μL。将混合液吹打混匀，反应条件：37 ℃，15 min（反转录反应）85 ℃，5 s，4 ℃，∞。cDNA产物稀释5倍后用于qPCR。用试剂盒SYBR®Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus）RR820A 检测 TRPV1 mRNA的表达量，内参引物为β-actin。基因的引物序列，见表1。

表1 各基因的引物序列

1.7 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件。计量资料符合正态分布以（）表示，采用单因素方差分析（ANOVA）、LSD-t、Dunnett T3、独立样本t检验;不符合正态分布以［M（P25，P75）］表示，采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 复方铁皮石斛对SHR大鼠血压的影响 本实验的模型组及正常组与本课题组其他实验共同完成，相关实验数据已有文献报告［7］；实验治疗前，模型组及各治疗组SBP均显著高于正常组（P＜0.05）［6］，各治疗组之间及与SHR模型组SBP相比均无显著差异（P＞0.05）。

治疗第8周给药3 h后：中剂量组SBP降压幅度与高剂量组接近；与低剂量组比较，中剂量组SBP降幅增加8.2 mmHg（P＜0.01），高剂量组降幅增加8.13 mmHg（P＜0.01）。治疗第8周给药24 h后：与模型组比较，各治疗组SBP均显著降低（P＜0.01）；中剂量组SBP降压幅度与高剂量组接近；与低剂量组比较，中剂量组SBP降幅增加9.89 mmHg（P＜0.01），高剂量组降幅增加 11.48 mmHg（P＜0.01）。

各治疗组SBP在治疗3 h均有显著下降，在治疗24 h均有所回升，但仍低于给药前SBP；在整个治疗过程中，高剂量组及中剂量组降压（SBP）效果显著高于低剂量组，见表2。

表2 复方铁皮石斛对SHR大鼠SBP的影响［mmHg，（）］

表2 复方铁皮石斛对SHR大鼠SBP的影响［mmHg，（）］

注：各组与模型组比较，■P＜0.01；复方低、中剂量组与复方高剂量组比较，★P＜0.01；复方低剂量组与复方中剂量组比较，●P＜0.01

中剂量组（n=6）疗程 低剂量组（n=6）高剂量组（n=6）模型组（n=6）正常组（n=5）给药8周3 h 184.27±1.94■★● 176.07±2.34■ 176.14±1.36■ 194.69±2.91 122.43±3.75给药8周24 h 190.60±1.26■★● 180.71±4.49■ 179.12±4.36■ 197.20±3.28 122.86±5.32

2.2 复方铁皮石斛对SHR大鼠TRPV1 mRNA的影响 与正常组比较，模型组TRPV1 mRNA表达显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组及中剂量组均显著下降（P＜0.05），高剂量组有下降趋势。将复方三个剂量组合计（复方高+中+低组）进行统计，TRPV1 mRNA表达较模型组显著下降（P＜0.05）。见图1。

图1 各组大鼠治疗第8周心脏TRPV1 mRNA表达量

3 讨论

高血压作为我国心脑血管疾病的首要危险因素，可导致如心肌梗死、脑卒中等多种致命性心脑血管疾病［7］。高血压也可导致一个或多个靶器官损害，具体定义为血压升高引起的动脉血管系统和/或其供应器官的结构或功能改变，靶器官包括大脑、心脏、肾脏、中央和外周动脉以及眼［7］。多项研究结果提示，中药辅助降压不仅能够减少降压药的使用剂量，在达到有效控制患者血压、改善临床症状的同时，还能够减轻药物不良反应及靶器官损害。本研究结果表明，给予SHR大鼠复方铁皮石斛灌胃治疗8周，具有显著降低血压的作用。

瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP）通道是介导Ca2+和Na+等单价和二价阳离子的一类跨细胞膜非选择性阳离子通道，在体内细胞增殖、分化、感知温度、pH值、渗透压、牵张力等理化刺激方面具有重要价值［7］。瞬时受体电位香草酸受体亚型1（TRPV1）是TRPV家族中研究最广泛的成员，在心、肝、肺、肾、背根神经节、感觉神经元中均有分布［7］。TRPV1对多种化学和物理刺激原敏感，因辣椒素（香草酸类物质）为TRPV1通道的激动剂，TRPV1又被称为辣椒素受体。中药及其复方具有多成分，多途径，多靶点协同作用的特点［7］。已有前期研究表明，复方铁皮石斛与单用厄贝沙坦降压作用接近，提示复方铁皮石斛对减少西药降压药的用量具有一定贡献，其降压疗效可能与AT2R的mRNA表达升高有关［6］。随着近年来研究的不断深入，大量研究发现TRPV1在心血管系统的表达主要集中于心肌细胞、血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，激活表达于血管平滑肌的TRPV1通道可导致大鼠颈动脉明显收缩［7］，辣椒素通过提高动脉平滑肌细胞内钙离子水平，可以使小鼠及大鼠的体内外小动脉均收缩，显著且剂量依赖性地减少冠状动脉血流，导致冠状动脉、骨骼肌和脂肪小动脉收缩，持续升高全身血压［7］。且TRPV1通道是一类瞬时开放而易于脱敏的离子通道，长期给予其激活剂使其活化后脱敏，阻断剂抑制其功能可产生相似的阻断信号传导的效应［8］；通过长期激活TRPV1通道，使该通道活化后脱敏可有效减少血管平滑肌增生，促进内皮细胞产生NO，引发血管舒张，降低小鼠血压［7］。本研究发现，治疗组的SHR大鼠TRPV1 mRNA表达水平较模型组显著降低，与正常组大鼠的表达水平接近，猜测复方铁皮石斛的降压疗效可能与下调TRPV1的mRNA表达有关，但尚需进一步研究验证。

综上所述，复方铁皮石斛对SHR大鼠降压疗效良好；其作用机制可能与降低SHR大鼠的TRPV1转录水平有关，提示或可通过抑制TRPV1通道从而降低血压，以TRPV1或其作用通路为靶点开发抗高血压药物或将具有重要的临床应用价值。