密花樫木根化学成分及其蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制活性研究

杨 帆，张亚梅

江西中医药大学 江西民族传统药现代科技与产业发展协同创新中心，南昌 330004

密花樫木(Dysoxylumdensiflorum)产于我国云南西双版纳(勐腊、景洪)，生于海拔520～800 m的湿性热带季节性谷边、河边坡地的雨林中[1]。现代研究表明，密花樫木中含有丰富的倍半萜、三萜、二萜、柠檬苦素类等化学成分，部分化合物具有良好的抗菌、抗肿瘤、镇痛等多种药理活性[2-5]。蛋白质酪氨酸磷酸酶(proteintyrosine phosphatase，PTPs)是一组催化蛋白质酪氨酸脱磷酸化的酶。蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(proteintyrosine phosphatase 1B，PTP-1B)通过激活的胰岛素受体和下游底物蛋白去磷酸化，在调节胰岛素作用中发挥关键作用[6-7]。因此PIP-1B是胰岛素信号转导通路中的关键的负调节蛋白，PTP-1B抑制剂是开发抗糖尿病药物的重要选择。课题组前期发现楝科樫木属植物多脉樫木中的二萜类成分表现出对PTP-1B抑制作用[8]，同属其他植物尚未见此活性研究报道。因此，为进一步探究密花樫木的活性成分，本实验通过硅胶柱色谱、半制备色谱、制备色谱结合核磁共振波谱技术对密花樫木根提取物乙酸乙酯萃取部位进行研究，以期为抑制PTP-1B活性成分的发现提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Bruker Avance Ⅲ 600型核磁共振仪(德国Bruker公司)；LC-3000型制备高效液相色谱仪(北京创新通恒科技有限公司)；制备型色谱柱(250 mm × 21.2 mm，10 μm)(北京慧得易科技有限责任公司)；半制备型色谱柱(Luna C-18，250 mm×10 mm，10 μm)(美国Phenomenex公司)；硅胶G(100～200，200～300目，青岛海洋化工厂)；酶标仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；重组人PTP-1B蛋白(Abcam公司)；氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)；三羟甲基氨基甲烷Tris(Gen-view科技有限公司)；硝基苯基磷酸二钠(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)(上海麦克林生化科技有限公司)；乙二胺四乙酸二钠(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)(北京索莱宝科技有限公司)；二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol，DTT)(北京索莱宝科技有限公司)；半制备及制备液相所用试剂为色谱纯，其他均为分析纯。

密花樫木根于2020年5月采自云南勐海，经江西中医药大学江西民族传统药现代科技与产业发展协同创新中心张亚梅副教授鉴定为楝科葱臭木属植物密花樫木根(Dysoxylumdensiflorum)。凭证标本(2020-05)存放于江西中医药大学江西民族传统药现代科技与产业发展协同创新中心。

1.2 方法

密花樫木根10 kg，粉碎，采用回流提取法用95%乙醇提取3次，每次1 h，合并提取液，过滤后减压浓缩得到总浸膏2400 g，将总浸膏用乙酸乙酯-水(1∶1)萃取，减压浓缩后得到乙酸乙酯萃取物491.35 g。取乙酸乙酯浸膏150 g用硅胶色谱柱(15 cm × 15 cm)分离，以石油醚-丙酮(10∶1、7∶1、4∶1、1∶1)和95%乙醇为洗脱剂，得到3个流分(MG1～MG3)。

MG1部位分别经两次制备HPLC(乙腈-水80∶20→95∶5、乙腈-水80∶20)得到MZ1a和MZ1b，MZ1a分别经正向半制备HPLC(石油醚-丙酮8∶1)、半制备HPLC(乙腈-水80∶20)得到化合物19(4.8 mg，tR= 12 min)、20(1.1 mg，tR= 17 min)。MZ1b分别经正向半制备HPLC(石油醚-丙酮8∶1)、半制备HPLC(乙腈-水70∶30)得到化合物18(1 mg，tR= 40 min)。

MG2部位分别经两次制备HPLC(乙腈-水60∶40→95∶5、乙腈-水50∶50)得到化合物10(91.7 mg，tR= 25 min)、22(30.3 mg，tR= 36 min)和MZ2a～MZ2f，MZ2a分别经正向半制备HPLC(石油醚-丙酮6∶1)、半制备HPLC(乙腈-水60∶40→95∶5)得到化合物7(1 mg，tR= 29 min)；MZ2b分别经正向半制备HPLC(石油醚-丙酮8∶1)、半制备HPLC(乙腈-水60∶40→95∶5)得到化合物5(1 mg，tR= 13 min)；MZ2c分别经正向半制备HPLC(石油醚-丙酮8∶1)、半制备HPLC(乙腈-水60∶40→95∶5)得到化合物11(1 mg，tR= 18 min)；MZ2d分别经正向半制备HPLC(石油醚-丙酮10∶1)、半制备HPLC(乙腈-水60∶40)得到化合物12(5.1 mg，tR= 24 min)、14(7 mg，tR= 23 min)、15(9.2 mg，tR= 26 min)、21(4.5 mg，tR= 26 min)；MZ2e分别经正向半制备HPLC(石油醚-丙酮10∶1)、半制备HPLC(乙腈-水60∶40)得到化合物6(1 mg，tR= 32 min)；MZ2f分别经正向半制备HPLC(石油醚-丙酮10∶1)、半制备HPLC(乙腈-水60∶40)得到化合物8(45.1 mg，tR= 50 min)、9(2.4 mg，tR= 50 min)、13(1 mg，tR= 17 min)。

MG3部位分别经两次制备HPLC(乙腈-水50∶50→80∶20、乙腈-水30∶70→60∶40)得到MZ3a～MZ3c，MZ3a分别经正向半制备HPLC(石油醚-丙酮3∶1)、半制备HPLC(乙腈-水40∶60)得到化合物17(3.3 mg，tR= 26 min)；MZ3b分别经正向半制备HPLC(石油醚-丙酮6∶1)、半制备HPLC(乙腈-水45∶55)得到化合物1(1 mg，tR= 17 min)、2(1 mg，tR= 19 min)、3(1.5 mg，tR= 22 min)、4(1 mg，tR= 29 min)、16(1 mg，tR= 34 min)；MZ3c分别经正向半制备HPLC(石油醚-丙酮3∶1)、半制备HPLC(乙腈-水55∶45)得到化合物23(11.4 mg，tR= 13 min)。

1.3 PTP-1B抑制活性测定

以对p-NPP作为底物，苏拉明钠为阳性对照，根据PTP-1B水解p-NPP 的磷酸基团而产生颜色反应来测定PTP-1B的活性。测试样品用DMSO溶解，配制为质量浓度10 mg/mL的母液，取母液10 μL加缓冲液至质量浓度梯度为0、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2 mg/mL，在96孔板中加入缓冲液(180 μL缓冲体系组成为11 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、55 mmol/L DTT、1.1 mmol/L EDTA、33 mmol/Lp-NPP)，37 ℃再回温5 min后加入p-NPP 50 μL，37 ℃再回温5 min后加入样品，酶20 μL，37 ℃孵育30 min后，加入mol/L NaOH 10 μL终止反应。以不含样品的系统为空白对照，利用SpectraMax MD5酶标仪测定405 nm处吸光度(A)[9]。应用Graphpad软件计算半抑制浓度(IC50)。

2 结果

2.1 结构鉴定

化合物1淡黄色胶状;分子式为C20H34O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.38(1H，t，J= 6.9 Hz，H-14)，4.14(2H，d，J= 7.1 Hz，H-15)，3.45(1H，d，J= 11.0 Hz，H-3)，1.67(3H，s，H-16)，1.04(3H，s，H-18)，0.96(3H，s，H-19)，0.84(3H，d，J= 6.8 Hz，H-20)，0.82(3H，s，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：25.2(C-1)，27.4(C-2)，76.3(C-3)，34.1(C-4)，136.3(C-5)，25.5(C-6)，27.1(C-7)，33.3(C-8)，40.5(C-9)，131.7(C-10)，39.8(C-11)，34.5(C-12)，140.9(C-13)，122.7(C-14)，59.4(C-15)，16.0(C-16)，16.5(C-17)，24.0(C-18)，20.1(C-19)，21.1(C-20)。以上数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定化合物1为5(10),13E-halimadiene-3α,15-diol。

化合物2白色粉末;分子式为C20H34O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.38(1H，tq，J= 6.9，1.3 Hz，H-14)，4.83(2H，dd，J= 36.5，1.5 Hz，H-18)，4.33(1H，t，J= 3.1 Hz，H-3)，4.13(2H，d，J= 6.9 Hz，H-15)，1.67(3H，d，J= 1.3 Hz，H-16)，1.24(3H，s，H-20)，0.81(3H，d，J= 6.4 Hz，H-17)，0.76(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：16.5(C-1)，27.0(C-2)，74.6(C-3)，160.8(C-4)，39.7(C-5)，38.1(C-6)，32.8(C-7)，36.7(C-8)，39.1(C-9)，48.5(C-10)，36.4(C-11)，34.6(C-12)，140.6(C-13)，122.8(C-14)，59.4(C-15)，16.5(C-16)，16.0(C-17)，109.4(C-18)，22.9(C-19)，18.2(C-20)。以上数据与文献[11]报道基本一致，故鉴定化合物2为(-)-agbanindiol A。

化合物3白色结晶;分子式为C21H36O4。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.67(1H，q，J= 1.2 Hz，H-14)，3.68(3H，s，15-OCH3)，3.58(1H，m，H-3)，2.16(3H，d，J= 1.2 Hz，H-16)，1.25(3H，s，H-18)，1.12(3H，s，H-19)，0.79(3H，d，J= 6.2 Hz，H-17)，0.74(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：16.5(C-1)，30.6(C-2)，76.6(C-3)，76.5(C-4)，41.5(C-5)，32.5(C-6)，26.6(C-7)，36.4(C-8)，38.9(C-9)，41.0(C-10)，36.9(C-11)，34.9(C-12)，161.9(C-13)，115.0(C-14)，167.4(C-15)，19.3(C-16)，16.1(C-17)，21.7(C-18)，17.4(C-19)，18.5(C-20)，51.0(15-OCH3)。以上数据与文献[12]报道基本一致，故鉴定化合物3为polylauioid H。

化合物4白色结晶;分子式为C20H34O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.68(1H，d，J= 1.5 Hz，H-3)，3.61(2H，m，H-15)，1.85(3H，d，J= 1.3 Hz，H-18)，1.08(3H，s，H-19)，0.86(3H，d，J= 6.6 Hz，H-20)，0.79(3H，m，H-16)，0.76(3H，s，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：35.5(C-1)，200.7(C-2)，172.7(C-3)，125.3(C-4)，39.5(C-5)，34.8(C-6)，26.8(C-7)，35.7(C-8)，38.4(C-9)，45.5(C-10)，29.9(C-11)，34.7(C-12)，29.3(C-13)，39.7(C-14)，60.7(C-15)，19.6(C-16)，15.6(C-17)，18.2(C-18)，18.9(C-19)，17.9(C-20)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故鉴定化合物4为2-oxopopulifolic acid。

化合物5透明胶状;分子式为C20H32O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.89(1H，m，H-3)，1.98(3H，d，J= 1.4 Hz，H-20)，1.13(3H，s，H-19)，0.91(9H，dt，J= 6.8，4.2 Hz，H-16，17，18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：48.3(C-1)，199.0(C-2)，128.9(C-3)，159.6(C-4)，74.6(C-5)，34.2(C-6)，40.3(C-7)，25.3(C-8)，35.9(C-9)，40.1(C-10)，33.5(C-11)，48.1(C-12)，210.7(C-13)，52.7(C-14)，24.9(C-15)，22.9(C-16)，23.0(C-17)，17.2(C-18)，21.4(C-19)，19.7(C-20)。以上数据与文献[14]报道基本一致，故鉴定化合物5为dysoxydenone C。

化合物6白色结晶;分子式为C21H32O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.73(1H，m，H-3)，5.62(1H，d，J= 1.4 Hz，H-13)，3.67(3H，s，15-OCH3)，1.88(3H，d，J= 1.3 Hz，H-16)，1.87(3H，d，J= 1.4 Hz，H-18)，1.11(3H，m，H-19)，0.89(3H，d，J= 6.7 Hz，H-17)，0.81(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：34.8(C-1)，200.2(C-2)，125.6(C-3)，172.4(C-4)，39.8(C-5)，35.5(C-6)，26.9(C-7)，35.9(C-8)，38.9(C-9)，45.4(C-10)，35.8(C-11)，26.8(C-12)，160.5(C-13)，115.7(C-14)，166.6(C-15)，25.3(C-16)，15.7(C-17)，18.9(C-18)，18.4(C-19)，17.7(C-20)，50.9(15-OCH3)。以上数据与文献[15]报道基本一致，故鉴定化合物6为2-oxo-ent-cleroda-3,13Z-dien-15-oic acid。

化合物7透明胶状;分子式为C20H32O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.86(1H，m，H-14)，5.71(1H，m，H-3)，5.19(1H，dt，J= 17.3，1.8 Hz，H-15a)，5.07(1H，dd，J= 10.8，1.8 Hz，H-15b)，1.87(3H，d，J= 1.3 Hz，H-18)，1.26(3H，s，H-16)，1.10(3H，s，H-19)，0.82(3H，d，J= 6.2 Hz，H-17)，0.80(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：34.9(C-1)，200.4(C-2)，125.5(C-3)，172.5(C-4)，39.8(C-5)，35.5(C-6)，26.8(C-7)，35.9(C-8)，38.3(C-9)，45.6(C-10)，31.2(C-11)，34.7(C-12)，73.1(C-13)，144.7(C-14)，112.1(C-15)，30.0(C-16)，15.6(C-17)，18.9(C-18)，18.3(C-19)，18.0(C-20)。以上数据与文献[16]报道基本一致，故鉴定化合物7为nakamurol B。

化合物8白色粉末;分子式为C21H32O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.68(1H，t，J= 1.2 Hz，H-3)，5.61(1H，q，J= 1.3 Hz，H-14)，3.63(3H，s，15-OCH3)，2.10(3H，d，J= 1.2 Hz，H-16)，1.85(3H，d，J= 1.2 Hz，H-18)，1.07(3H，s，H-19)，0.80(3H，d，J= 6.1 Hz，H-17)，0.78(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：34.8(C-1)，199.8(C-2)，125.3(C-3)，172.2(C-4)，39.7(C-5)，35.4(C-6)，26.7(C-7)，35.9(C-8)，38.6(C-9)，45.5(C-10)，35.4(C-11)，33.9(C-12)，160.2(C-13)，115.0(C-14)，166.9(C-15)，19.0(C-16)，15.5(C-17)，18.8(C-18)，18.2(C-19)，17.7(C-20)，50.6(15-OCH3)。以上数据与文献[17]报道基本一致，故鉴定化合物8为methyl (13E)-2-oxoneocleroda-3,13-dien-15-oate。

化合物9白色结晶;分子式为C22H34O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.72(1H，q，J= 1.1 Hz，H-3)，5.31(1H，td，J= 7.3，1.6 Hz，H-14)，4.52(1H，m，H-15)，2.04(3H，s，OAc)，1.88(3H，s，H-18)，1.74(3H，m，H-16)，1.11(3H，s，H-19)，0.85(3H，d，J= 6.3 Hz，H-17)，0.80(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：36.3(C-1)，200.4(C-2)，125.9(C-3)，172.7(C-4)，40.2(C-5)，35.4(C-6)，27.2(C-7)，36.5(C-8)，39.2(C-9)，45.9(C-10)，35.9(C-11)，25.5(C-12)，143.5(C-13)，119.2(C-14)，61.1(C-15)，24.1(C-16)，16.1(C-17)，19.3(C-18)，18.7(C-19)，18.2(C-20)，21.5(CH3COO)，171.4(CH3COO)。以上数据与文献[18]报道基本一致，故鉴定化合物9为15-acetoxy-ent-3,13E-clerodadien-2-one。

化合物10白色结晶;分子式为C20H34O3。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：5.34(1H，m，H-14)，4.06(2H，d，J= 6.8 Hz，H-15)，3.48(1H，q，J= 3.2 Hz，H-3)，1.85(1H，dd，J= 12.4，2.0 Hz，H-10)，1.67(3H，d，J= 1.3 Hz，H-16)，1.19(3H，s，H-18)，1.11(3H，s，H-19)，0.79(3H，d，J= 5.9 Hz，H-17)，0.74(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：17.6(C-1)，31.0(C-2)，76.8(C-3)，77.3(C-4)，42.5(C-5)，33.5(C-6)，27.9(C-7)，37.3(C-8)，39.7(C-9)，41.7(C-10)，38.4(C-11)，34.1(C-12)，140.7(C-13)，124.2(C-14)，59.4(C-15)，16.6(C-16)，16.5(C-17)，21.3(C-18)，17.9(C-19)，19.0(C-20)。以上数据与文献[17]报道基本一致，故鉴定化合物10为(3α,4β,13E)-neoclerod-13-ene-3,4,15-triol。

化合物11透明胶状;分子式为C20H34O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.89(1H，dd，J= 17.4，10.8 Hz，H-14)，5.20(1H，dd，J= 17.4，1.2 Hz，H-15a)，5.05(1H，dd，J= 10.8，1.2 Hz，H-15b)，1.27(3H，s，H-16)，1.04(3H，s，H-18)，0.95(3H，s，H-19)，0.82(6H，d，J= 6.4 Hz，H-17，20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：25.4(C-1)，27.7(C-2)，76.5(C-3)，40.1(C-4)，136.4(C-5)，27.4(C-6)，27.6(C-7)，33.5(C-8)，40.4(C-9)，111.9(C-10)，30.1(C-11)，36.6(C-12)，73.5(C-13)，145.4(C-14)，100.1(C-15)，24.1(C-16)，16.1(C-17)，25.8(C-18)，20.4(C-19)，21.5(C-20)。以上数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定化合物11为5(10),14-halimadiene-3α,13ξ-diol。

化合物12白色结晶;分子式为C20H32O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.87(1H，m，H-3)，1.89(3H，d，J= 1.5 Hz，H-20)，0.91(9H，m，H-12，17，18)，0.84(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：54.6(C-1)，199.4(C-2)，127.0(C-3)，163.3(C-4)，47.9(C-5)，26.1(C-6)，43.5(C-7)，24.5(C-8)，40.2(C-9)，37.8(C-10)，33.8(C-11)，16.9(C-12)，48.0(C-13)，210.9(C-14)，52.6(C-15)，24.7(C-16)，22.8(C-17)，22.7(C-18)，17.2(C-19)，22.1(C-20)。以上数据与文献[19]报道基本一致，故鉴定化合物12为dysokusone A。

化合物13淡黄色胶状;分子式为C18H28O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.72(1H，s，H-3)，2.12(3H，m，H-16)，1.88(3H，d，J= 2.0 Hz，H-18)，1.11(3H，d，J= 2.6 Hz，H-19)，0.83(6H，m，H-17，20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：35.1(C-1)，200.3(C-2)，125.7(C-3)，172.6(C-4)，40.0(C-5)，35.7(C-6)，27.0(C-7)，36.4(C-8)，38.4(C-9)，46.2(C-10)，30.9(C-11)，37.2(C-12)，208.6(C-13)，30.3(C-16)，15.9(C-17)，18.4(C-18)，19.1(C-19)，17.9(C-20)。以上数据与文献[20]报道基本一致，故鉴定化合物13为14,15-dinorclerod-3-ene-2,13-dione。

化合物14透明胶状;分子式为C20H32O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.67(1H，s，H-14)，2.93(1H，d，J= 1.8 Hz，H-3)，2.16(3H，s，H-16)，1.17(3H，s，H-18)，1.04(3H，s，H-19)，0.79(3H，d，J= 6.3 Hz，H-17)，0.66(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：19.8(C-1)，28.2(C-2)，62.3(C-3)，66.6(C-4)，37.4(C-5)，35.2(C-6)，28.4(C-7)，37.2(C-8)，39.3(C-9)，48.1(C-10)，36.2(C-11)，36.5(C-12)，164.0(C-13)，115.2(C-14)，171.9(C-15)，17.0(C-16)，16.1(C-18)，15.5(C-17)，18.7(C-19)，19.5(C-20)。以上数据与文献[21]报道基本一致，故鉴定化合物14为3,4-epoxyclerodan-13E-en-15-oic acid。

化合物15透明胶状;分子式为C20H30O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.03(1H，s，H-13)，5.87(1H，m，H-3)，2.27(3H，s，H-12)，2.12(1H，m，H-16)，1.86(3H，d，J= 1.6 Hz，H-20)，0.93(3H，s，H-17)，0.92(3H，s，H-18)，0.90(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：53.8(C-1)，199.4(C-2)，126.9(C-3)，163.2(C-4)，47.5(C-5)，24.8(C-6)，40.8(C-7)，27.6(C-8)，39.7(C-9)，37.5(C-10)，161.5(C-11)，21.3(C-12)，124.6(C-13)，201.0(C-14)，54.5(C-15)，25.2(C-16)，22.8(C-17)，22.8(C-18)，16.9(C-19)，22.0(C-20)。以上数据与文献[22]报道基本一致，故鉴定化合物15为dysokusone G。

化合物16透明胶状;分子式为C22H38O4。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.32(1H，t，J= 7.4 Hz，H-14)，4.54(2H，m，H-15)，3.58(1H，t，J= 2.9 Hz，H-3)，2.04(3H，s，OAc)，1.24(3H，s，H-18)，1.12(3H，s，H-19)，0.80(3H，d，J= 6.0 Hz，H-17)，0.72(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：16.6(C-1)，21.3(C-2)，76.6(C-3)，76.5(C-4)，41.5(C-5)，32.5(C-6)，26.6(C-7)，36.3(C-8)，39.0(C-9)，40.9(C-10)，37.4(C-11)，26.0(C-12)，144.4(C-13)，118.4(C-14)，61.1(C-15)，23.9(C-16)，16.1(C-17)，21.6(C-18)，17.4(C-19)，18.4(C-20)，171.3(CH3COO)，30.6(CH3COO)。以上数据与文献[23]报道基本一致，故鉴定化合物16为15-acetyloxyl-3α,4β-dihydroxy-neoclerod-13Z-ene。

化合物17透明胶状;分子式为C20H36O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.40(1H，t，J= 7.0 Hz，H-14)，4.14(2H，d，J= 6.9 Hz，H-15)，1.68(3H，s，H-16)，1.28(3H，s，H-18)，1.02(3H，s，H-19)，0.79(3H，d，J= 5.4 Hz，H-20)，0.72(3H，s，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：27.3(C-1)，32.0(C-2)，33.1(C-3)，42.1(C-4)，76.2(C-5)，37.1(C-6)，37.1(C-7)，23.5(C-8)，43.2(C-10)，38.9(C-11)，36.8(C-12)123.2(C-13)，40.9(C-14)，59.6(C-15)，21.2(C-16)，18.4(C-17)，16.7(C-18)，16.2(C-19)，14.9(C-20)。以上数据与文献[24]报道基本一致，故鉴定化合物17为[1α(E),2β,4aβ,8aα]-5-(decahydro-4a-hydroy-1,2,5,5-tetra-methyl-1-naphthalenyl)-3-methl-2-penten-1-ol。

化合物18淡黄色胶状;分子式为C20H34O。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.38(1H，tq，J= 6.9，1.3 Hz，H-14)，5.17(1H，ddt，J= 4.2，2.7，1.2 Hz，H-3)，4.12(2H，d，H-15)，1.66(3H，m，H-16)，1.57(3H，d，J= 3.1 Hz，H-20)，0.98(3H，d，J= 0.7 Hz，H-19)，0.79(3H，d，J= 6.4 Hz，H-17)，0.70(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：36.8(C-1)，27.0(C-2)，120.5(C-3)，144.6(C-4)，38.3(C-5)，36.9(C-6)，27.6(C-7)，36.4(C-8)，38.7(C-9)，46.5(C-10)，18.4(C-11)，32.9(C-12)，140.9(C-13)，123.0(C-14)，59.5(C-15)，16.6(C-16)，18.5(C-17)，18.1(C-18)，20.0(C-19)，16.1(C-20)。以上数据与文献[25]报道基本一致，故鉴定化合物18为kolavenol。

化合物19无色结晶;分子式为C20H32O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.71(1H，m，H-3)，5.37(1H，tq，J= 6.9，1.3 Hz，H-14)，4.12(2H，m，H-15)，1.88(3H，d，J= 1.3 Hz，H-18)，1.66(3H，m，H-16)，1.11(3H，d，J= 0.7 Hz，H-19)，0.83(3H，dd，J= 4.2，1.9 Hz，H-17)，0.80(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：35.1(C-1)，200.6(C-2)，125.6(C-3)，172.8(C-4)，40.0(C-5)，35.9(C-6)，27.0(C-7)，36.1(C-8)，138.9(C-9)，45.8(C-10)，35.7(C-11)，32.4(C-12)，40.0(C-13)，123.5(C-14)，59.5(C-15)，16.8(C-16)，15.9(C-17)，19.1(C-18)，18.5(C-19)，18.1(C-20)。以上数据与文献[17]报道基本一致，故鉴定化合物19为(13E)-2-oxoneocleroda-3,13-dien-15-ol。

化合物20透明胶状;分子式为C20H34O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.42(1H，tq，J= 7.0，1.3 Hz，H-3)，5.35(1H，dt，J= 4.6，1.5 Hz，H-14)，4.15(1H，s，H-2)，4.13(2H，d，J= 7.0 Hz，H-15)，1.64(3H，s，H-16)，0.94(3H，s，H-19)，0.81(3H，d，J= 6.6 Hz，H-18)，0.73(3H，s，H-17)，0.73(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：27.6(C-1)，65.5(C-2)，150.1(C-3)，122.2(C-4)，38.5(C-5)，36.4(C-6)，36.6(C-7)，36.4(C-8)，38.9(C-9)，41.0(C-10)，28.1(C-11)，32.4(C-12)，141.2(C-13)，122.9(C-14)，59.6(C-15)，16.7(C-16)，16.0(C-17)，18.2(C-18)，18.7(C-19)，18.5(C-20)。以上数据与文献[26]报道基本一致，故鉴定化合物20为2β-hydroxykolavenol。

化合物21透明胶状;分子式为C20H34O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.39(1H，ddq，J= 7.0，5.5，1.3 Hz，H-14)，4.14(2H，d，J= 6.9 Hz，H-15)，2.92(1H，d，J= 1.9 Hz，H-3)，1.67(3H，d，J= 1.3 Hz，H-16)，1.17(3H，s，H-18)，1.04(3H，s，H-19)，0.78(3H，m，H-17)，0.64(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：15.5(C-1)，28.4(C-2)，62.4(C-3)，66.6(C-4)，37.4(C-5)，37.3(C-6)，28.3(C-7)，36.2(C-8)，39.2(C-9)，48.0(C-10)，37.0(C-11)，33.2(C-12)，140.7(C-13)，123.1(C-14)，59.6(C-15)，16.7(C-16)，16.1(C-17)，17.0(C-18)，19.9(C-19)，18.8(C-20)。以上数据与文献[27]报道基本一致，故鉴定化合物21为ent-3β,4β-epoxyclerod-13E-en-15-ol。

化合物22透明胶状;分子式为C22H36O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.69(1H，p，J= 1.1 Hz，H-3)，4.05(2H，m，H-15)，2.02(3H，s，OAc)，1.86(3H，d，J= 1.4 Hz，H-16)，1.08(3H，m，H-18)，0.87(3H，d，J= 6.5 Hz，H-20)，0.79(3H，d，J= 6.2 Hz，H-17)，0.77(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：35.6(C-1)，200.5(C-2)，125.6(C-3)，171.3(C-4)，39.9(C-5)，35.0(C-6)，27.0(C-7)，35.6(C-8)，38.6(C-9)，45.7(C-10)，34.7(C-11)，30.3(C-12)，29.5(C-13)，35.9(C-14)，62.9(C-15)，19.4(C-16)，15.8(C-17)，18.5(C-18)，19.1(C-19)，18.1(C-20)，172.7(CH3COO)，21.1(CH3COO)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故鉴定化合物22为2-oxodihydrokolavenol acetate。

化合物23透明胶状;分子式为C22H40O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.41(1H，m，H-14)，4.13(2H，d，J= 7.0 Hz，H-15)，3.79(1H，t，J= 2.9 Hz，H-3)，3.34(2H，2dq，J= 11.0，7.0 Hz，4-OCH2CH3)，3.11(3H，d，J= 7.0 Hz，4-OCH2CH3)，1.68(3H，s，H-16)，1.15(3H，s，H-18)，1.09(3H，s，H-19)，0.76(3H，d，J= 6.3 Hz，H-17)，0.70(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：16.2(C-1)，30.7(C-2)，72.0(C-3)，79.4(C-4)，42.4(C-5)，32.0(C-6)，26.9(C-7)，36.1(C-8)，38.6(C-9)，39.5(C-10)，37.3(C-11)，33.2(C-12)，141.5(C-13)，123.0(C-14)，59.6(C-15)，16.3(C-16)，16.6(C-17)，14.5(C-18)，17.7(C-19)，18.5(C-20)，57.0(4-OCH2CH3)，16.3(4-OCH2CH3)。以上数据与文献[17]报道基本一致，故鉴定化合物23为(3α,4β,13E)-4-ethoxyneoclerod-13-ene-3,15-diol。

2.2 PTP-1B抑制活性筛选结果

本文对分离得到的23个化合物进行PTP-1B抑制活性筛选，结果见表1，与阳性药苏拉明钠对比(抑制率62.31%，IC50值为134.81±8.36 μmol/L)，化合物3、12、16、21表现出PTP-1B抑制活性，IC50值分别为31.25±0.64、0.30±0.56、0.64±0.51、78.50±0.59 μmol/L。

表1 化合物对PTP-1B的影响Table 1 Effects of the compounds on PTP-1B

3 讨论与结论

本项研究从密花樫木根乙酸乙酯萃取物中共分离得到23个成分，并且进行PTP-1B抑制活性筛选，在此基础上对构效关系进行初步探讨。化合物3、16、21均为clerodane型，化合物12为prenyleudesmane型，且抑制效果最好，提示prenyleudesmane型二萜抑制活性强于clerodane型；化合物3、21均为E构型，化合物16为Z构型，而化合物16表现出较强的抑制活性，仅次于化合物12，提示Z型二萜类化合物抑制活性较强；化合物3、16结构中含有乙酰基，且抑制活性均较好，乙酰基是否与抑制活性有关还需进一步探讨。

二萜类成分在小分子天然PTP-1B抑制剂开发中发挥了不错的潜力，樫木属植物是二萜类成分的丰富来源[28]，从该属植物中挖掘天然来源的抗糖尿病候选药物是值得进一步探索。