α-倒捻子素通过激活ROS/p38 MAPK/Bax级联反应诱导B淋巴瘤Ramos细胞凋亡的机制研究

蔡紫微，孙毅松，汪 林， 廖玉娇，余 欢，黄 敏，李润滋，李敏惠

1成都医学院基础医学院；2成都医学院生物科学与技术学院；3成都医学院药学院； 4成都医学院科研实验中心，成都 610500

B淋巴瘤(B lymphoma)是血液系统常见恶性肿瘤之一，化疗是B淋巴瘤的主要治疗手段，临床常用药物包括环磷酰胺、多柔比星、长春新碱等。化疗能有效改善淋巴瘤患者的生存率及预后，但仍存在高毒性、高副作用和易耐药等缺点[1,2]。从天然产物中寻找安全低毒的有效药物是抗肿瘤领域的研究热点。研究学者们从植物来源的中药中分离并鉴定具有抗淋巴瘤活性的天然化合物，同时探究其分子作用机制，如从红豆蔻、黄芩中分离得到黄酮类化合物杨梅素和黄芩素，经验证二者分别通过靶向bruton tyrosine kinase(BTK)及PI3K/AKT信号通路发挥抗淋巴瘤作用[3]。莽吉柿(GarciniamangostanaL.)俗称山竹、倒捻子等，素有"水果皇后"的美誉。山竹果壳含有黄酮类化合物、呫吨酮类化合物、花色苷、原花青素等活性成分，在某些东南亚地区常作为传统药物用于治疗腹泻、痢疾、感染等疾病[4,5]。α-倒捻子素(α-mangostin，α-Ma)是一种氧杂蒽酮类化合物，具有多种生物学活性，是山竹果壳主要活性成分之一。研究显示，α-Ma具有潜在抗癌性能，对胃癌、乳腺癌、肝癌、胶质母细胞瘤等均表现出抑制活性[6]。然而，α-Ma对B淋巴瘤的增殖抑制作用及其分子作用机制尚未见报道。基于此，本研究以人B淋巴瘤Ramos细胞为研究对象，观察α-Ma对Ramos细胞增殖、凋亡的影响，旨在探讨α-Ma对B淋巴瘤的增殖抑制作用及其潜在分子作用机制，为α-Ma的抗肿瘤活性提供新见解，为基于α-Ma的类似物改造及临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 药物

α-倒捻子素(Cat.No.A0406，纯度≥98%)购自成都曼思特生物科技公司，化学结构和分子式见图1。

图1 α-Ma的化学结构Fig.1 Chemical structure of α-Ma

1.2 主要试剂

胎牛血清(Cat.No.10100147)、RPMI-1640基础培养基(Cat.No.72400047)购自美国Gibco公司；CCK-8检测试剂盒(Cat.No.CK04)购自日本同仁化学研究所；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(Cat.No.C1062L)、线粒体膜电位检测试剂盒(Cat.No.C2006)、ROS检测试剂盒(Cat.No.S0033M)、RIPA强效裂解液(Cat.No.P0013B)购自上海碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Cat.No.BL521A)购自中国白鲨(Biosharp)科技有限公司；ECL发光液(Cat.No.WBULS0500)购自美国Millipore公司；caspase-9(Cat.No.9502)、cleaved caspase-9(Cat.No.9505)、caspase-3(Cat.No.9662)、cleaved caspase-3(Cat.No.9664)、cleaved PARP(Cat.No.5625)、Bim(Cat.No.2933)、Bax(Cat.No.5023)、p-p38 MAPK(Cat.No.4511)、GAPDH(Cat.No.5174)、偶联辣根过氧化物酶的anti-rabbit IgG(Cat.No.7074)购自美国CST公司。

1.3 细胞培养

人B淋巴瘤Ramos细胞(成都医学院邹强教授馈赠)，保存于成都医学院科研实验中心，其STR鉴定结果与ATCC一致。根据ATCC推荐的培养方法，用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养液传代培养。

1.4 细胞增殖抑制实验

Ramos细胞以2×104个/孔的密度接种在96孔细胞培养板中；加入供试的α-Ma，药物作用浓度分别为0、7.5、10、15、20、30、40 μmol/L，每个浓度设置三个复孔，同时设置空白孔；药物作用24 h和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂；孵育2～4 h后，用酶标仪(BioTek Powerwave XS，美国)检测450 nm处的OD值。按照以下公式计算相应药物浓度下细胞的抑制率。通过GraphPad Prism 9.0软件绘制细胞生长抑制曲线，并计算α-Ma对Ramos细胞的半数抑制浓度(IC50)。

1.5 活性氧检测

Ramos细胞以6×105个/孔的密度接种在6孔细胞培养板中；加入α-Ma(0、10、15、20 μmol/L)处理12 h后，收集细胞并用DCFH-DA荧光探针37 ℃避光染色20 min；磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)离心洗涤两次，使用流式细胞仪(ACEA NovoCyte，美国)检测DCF荧光并分析细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平。

1.6 细胞凋亡检测

α-Ma(0、10、15、20 μmol/L)作用Ramos细胞24 h后，于倒置显微镜20×物镜下(Olympus，日本)观察Ramos细胞的形态变化；观察到细胞有明显凋亡样形态改变后，离心收集所有细胞，用含Annexin V-FITC/PI两种荧光染料的结合液重悬细胞，避光染色20 min；流式细胞仪检测并分析细胞凋亡情况。

1.7 线粒体膜电位检测

α-Ma处理Ramos细胞24 h后，离心收集细胞；用含有JC-1荧光探针的染色液重悬细胞，37 ℃避光染色20 min；离心洗涤两次，PBS重悬，用流式细胞仪采集染色后的细胞并分析线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)的改变情况。

1.8 蛋白免疫印迹

α-Ma处理Ramos细胞24 h后，用RIPA强效裂解液(已加蛋白酶及磷酸酶抑制剂)裂解细胞，4 ℃离心收集蛋白上清，通过BCA法测定蛋白浓度；采用蛋白免疫印迹技术(Western blot，WB)分析细胞凋亡相关信号通路蛋白caspase-3/-9、cleaved caspase-3/-9、cleaved PARP、Bim、Bax、p-p38 MAPK的表达情况。以GAPDH为内参，用Image Lab软件(美国Bio-Rad公司)分析结果。

1.9 统计学方法

2 实验结果

2.1 α-Ma抑制Ramos细胞增殖

α-Ma作用Ramos细胞24 h和48 h后，通过CCK-8法检测细胞活力；利用GraphPad Prism 9.0软件绘制细胞生长抑制曲线，并计算α-Ma对Ramos细胞的IC50值。结果发现，α-Ma以药物浓度依赖和时间依赖的方式抑制Ramos细胞增殖，其24 h和48 h的IC50值分别为14.84 μmol/L和8.087 μmol/L(见图2)。

图2 α-Ma对B淋巴瘤Ramos细胞的生长抑制作用Fig.2 Growth inhibitory effect of α-Ma on B lymphoma Ramos cells

2.2 α-Ma诱导 Ramos细胞内活性氧水平增加

α-Ma(0、10、15、20 μmol/L)作用Ramos细胞12 h后，利用流式细胞仪检测经DCFH-DA荧光探针染色的细胞，结果发现Ramos细胞内ROS水平以α-Ma浓度依赖的方式增加，分别为(2.05±0.26)%、(6.38±0.05)%、(13.20±0.14)%、(20.71±0.5)%，和0 μmol/Lα-Ma组相比，差异具有统计学意义(见图3)。

2.3 α-Ma诱导Ramos细胞凋亡

α-Ma作用Ramos细胞24 h后，采用倒置显微镜观察Ramos细胞形态的变化。结果发现，α-Ma诱导Ramos细胞形态发生典型的凋亡样改变，0 μmol/Lα-Ma组Ramos细胞形态分明，饱满透亮，15 μmol/Lα-Ma组Ramos细胞胞体收缩、出泡，细胞拉长出现钉状突起，部分细胞细胞膜破裂，细胞溶解(见图4)。

细胞凋亡是细胞程序性死亡的方式之一。α-Ma(0、10、15、20 μmol/L)作用Ramos细胞24 h后，对细胞进行Annexin V-FITC/PI双染，流式细胞仪检测分析发现位于Q4-2区(表示晚期凋亡细胞)和Q4-4区(表示早期凋亡细胞)的总凋亡细胞比例分别为(5.92±0.25)%、(12.58±1)%、(42.84±2.05)%、(71.9±1.78)%，和0 μmol/Lα-Ma组相比，差异具有统计学意义(见图5A)。同时，WB结果显示α-Ma下调caspase-3/-9的表达，上调cleaved caspase-3/-9和cleaved PARP的表达，差异具有统计学意义(见图5C)。结果提示α-Ma可诱导Ramos细胞凋亡。

图3 α-Ma对B淋巴瘤Ramos细胞内ROS水平的影响Fig.3 Effect of α-Ma on intracellular ROS level in B lymphoma Ramos cells注：A：流式细胞仪检测并分析5 000个经DCFH-DA染色的Ramos细胞；B：和0 μmol/L α-Ma组比较， **P<0.01。Note:A:Analysis of 5 000 DCFH-DA-stained Ramos cells by flow cytometry.B:Compared with 0 μmol/L α-Ma group,**P<0.01.

图4 α-Ma作用后Ramos细胞形态学成像Fig.4 Morphological imaging of Ramos cells induced by α-Ma

图5 α-Ma对B淋巴瘤Ramos细胞的凋亡诱导效应Fig.5 Apoptosis-inducing effect of α-Ma on B lymphoma Ramos cells注：A：流式细胞仪检测并分析5 000个经Annexin V-FITC/PI双染的Ramos细胞；C：WB检测α-Ma对Ramos细胞凋亡相关蛋白表达的影响；B和D：和0 μmol/L α-Ma组比较， *P<0.05，***P<0.001。Note:A:5 000 Ramos cells double-stained with Annexin V-FITC/PI was detected by flow cytometry;C:The effect of α-Ma on apoptosis-related protein expression of Ramos cells was detected by WB;B and D:Compared with 0 μmol/L α-Ma group,*P<0.05,***P<0.001.

2.4 线粒体途径参与α-Ma诱导Ramos细胞凋亡

MMP的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件，JC-1荧光探针从红色荧光到绿色荧光的转变可以反映细胞MMP的改变。使用流式细胞仪检测JC-1染色后的Ramos细胞，结果发现，α-Ma(0、10、15、20 μmol/L)诱导细胞MMP分别降低(4.17±0.49)%、(44.02±2.5)%、(69.76±3.50)%、(92.64±3)%，和0 μmol/Lα-Ma组相比，差异具有统计学意义(见图6A)。同时，通过WB检测线粒体途径相关蛋白的表达发现，α-Ma诱导促凋亡蛋白Bim、Bax表达增加，差异具有统计学意义(P<0.05)(见图6C)。提示线粒体途径参与α-Ma诱导Ramos细胞凋亡。

图6 α-Ma通过线粒体途径诱导B淋巴瘤Ramos细胞凋亡Fig.6 α-Ma induces apoptosis in B lymphoma Ramos cells via the mitochondrial pathway注：A：流式细胞仪检测分析5 000个JC-1荧光染色的Ramos细胞；C：WB检测α-Ma对Ramos细胞线粒体途径相关蛋白表达的影响；B和D：和0 μmol/L α-Ma组比较， *P<0.05，***P<0.001。Note:A:5 000 Ramos cells stained with JC-1 fluorescent probe were detected and analyzed by flow cytometry;C:The effect of α-Ma on the expression of mitochondrial pathway-related proteins in Ramos cells was detected by WB;B and D:Compared with 0 μmol/L α-Ma group,*P<0.05,***P<0.001.

2.5 p38 MAPK参与α-Ma对Ramos细胞的凋亡诱导过程

p38 MAPK参与细胞多种生理和病理过程，包括细胞凋亡、细胞应激、细胞周期和机体的炎症反应等。通过WB检测发现α-Ma能诱导p38 MAPK活化，即上调p-p38 MAPK的表达，和0 μmol/Lα-Ma组相比，差异具有统计学意义(见图7)。研究结果提示p38 MAPK参与α-Ma对Ramos细胞的凋亡诱导过程。

图7 α-Ma对B淋巴瘤Ramos细胞p38 MAPK的影响Fig.7 Effect of α-Ma on p38 MAPK in B lymphoma Ramos cells注：A：WB检测α-Ma对Ramos细胞p38 MAPK表达的影响；B：和0 μmol/L α-Ma组相比， *P<0.05。Note:A:The effect of α-Ma on the expression of p38 MAPK in Ramos cells was detected by WB.B:Compared with 0 μmol/L α-Ma group,*P<0.05.

3 讨论与结论

从天然产物中分离提取的未经修饰的化合物有着多靶点、安全性高、广泛易得等优点，在治疗肿瘤方面展示出良好的优势[7,8]。据统计，现有抗肿瘤药物中约60%是天然产物或来源于天然产物，如紫杉醇、长春新碱[9]。α-Ma来源于天然产物山竹，已被报道通过多种机制发挥抗肿瘤作用。α-Ma通过JNK和AKT通路诱导软骨肉瘤细胞凋亡[10]；通过ERK和p38通路诱导口腔癌细胞凋亡[11]；通过JNK和p38通路抑制乳腺癌增殖[12]；通过自噬促进胃癌细胞的化学敏感性[13]等。在本项研究中，我们首次发现了α-Ma对B淋巴瘤Ramos细胞的增殖抑制作用，α-Ma以药物浓度依赖和时间依赖的方式抑制淋巴瘤Ramos细胞增殖。

ROS水平过高，可引起机体DNA氧化损伤和蛋白质的表达异常，进而诱导细胞凋亡。p38 MAPK是MAPK家族中的重要成员，p38 MAPK的活化在多种抗肿瘤药物诱导癌细胞凋亡的过程发挥重要作用。研究发现，ROS可以磷酸化激活p38 MAPK，进而诱导Bcl-2家族成员Bax从细胞质转位到线粒体外膜[14,15]。Bax转位至线粒体膜可扩大通透性孔道，改变线粒体内外室的质子梯度，降低线粒体跨膜电位，释放促凋亡物质(如AIF和Cyt-c)。Cyt-c释放到细胞质后，与凋亡酶激活因子(Apaf-1)相互作用，并在ATP和dATP的协助下形成凋亡复合体，凋亡复合体招募并激活pro-caspase-9，活化的caspase-9进一步激活caspase-3/7，启动caspase级联反应，切割PARP等底物，最终诱导细胞凋亡[16]。Bim作为Bcl-2家族另一成员，通过直接结合或竞争结合两种方式促进Bax的活化[17]。我们的研究结果发现α-Ma能增加Ramos细胞内ROS水平，降低MMP，同时能上调p-p38、Bax、Bim的表达，活化caspase-3/9和PARP，诱导Ramos细胞凋亡。

根据以上结果，我们推测α-Ma抑制淋巴瘤Ramos细胞增殖的可能机制是α-Ma活化ROS/p38 MAPK/Bax级联反应诱导B淋巴瘤细胞凋亡。研究阐述了α-Ma的抗B淋巴瘤活性及其可能机制，为以α-Ma为基础的抗肿瘤药物的研发提供新思路。