高发区食管癌生物样本库的建立与管理

郭艺博，刘怡文，杨海军，代宁涛，周福有，高社干

食管癌作为最常见的恶性肿瘤之一，高低发区的发病率及死亡率相差甚远，具有显著的地域差异，其在不同地区的独特发病机制提示环境因素可能是食管癌的重要致病因素之一[1]。河南省作为我国食管癌高发区，已经将食管癌作为全省重点防控的疑难病症之一[2]。因此，在高发区寻找食管癌高危人群的肿瘤标志物对于食管癌的病因学研究具有十分重要的意义[3]。本课题组前期研究发现牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)感染与高发区食管癌患者的分化程度、淋巴结转移、TNM分期和生存率降低密切相关[4]。随后进一步发现Pg在上消化道中呈上高下低分布，并在体外实验中证实，Pg可通过免疫逃逸、自噬及Smad/YAP/TAZ相关信号通路促进食管癌的恶性进展[5-7]，为食管癌高发区人群提供了新的具有重要预后价值的生物标志物。因此构建以食管癌组织、口腔及血液样本为主体，搭配完整临床病理及随访资料的生物样本库，对食管病因学研究及防治工作具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象所有食管癌组织、口腔、血液样本均来自2016年9月至2020年5月河南科技大学第一附属医院、安阳市肿瘤医院行上消化道内视镜检查及食管癌根治术的患者。纳入标准：①年龄≥18岁；②组织病理学确诊为食管癌且未经过任何治疗；③既往体健。排除标准：①近6个月有牙周或口腔治疗史；②1个月内服用过抗生素；③牙齿总数少于20颗(至少有4颗磨牙)；④传染病史；⑤术前进行放化疗治疗。所有患者在收集临床资料和标本前均签署知情同意书。

1.2 主要仪器设备生物样本库建于河南科技大学第一附属医院新区医院分子生物实验室，设有样本预处理室及样本储藏室。配备样本信息管理系统、高速冷冻离心机(Eppendorf)及-80 ℃超低温冰箱(Thermo)并装有温度报警系统，可实时监测样品储存环境。

1.3 主要试剂耗材试剂：DNA保护液，无液氮组织RNA保护液(QIAGEN)。耗材：无菌无酶EP管、EDTA抗凝采血管、口腔拭子、一次性活检钳、一次性内镜细胞刷、冻存管、冻存盒。器械：灭菌剪刀、灭菌镊子、手术刀片、移液器。

1.4 患者临床资料收集首先与临床科室及病案室负责人沟通联系，并告知病人及家属，签署知情同意书。通过临床病案信息管理系统收集病人包括年龄、性别、个人史、家族史和联系方式在内的基础信息，以及包括病理诊断、治疗方案在内的临床信息。每3个月电话随访更新1次患者疾病进展情况，持续至第60个月，以手术当天开始至以食管癌导致的死亡事件为终点，统计所有入组患者的总生存时间，并排除非食管癌导致的死亡病例。

1.5 口腔样本收集于患者入院后第二天刷牙前采集口腔样本。采用一次性口腔拭子，于患者口腔4个象限第二、三磨牙的牙龈处，擦拭并旋转拭子，将黏附有龈沟液的拭子放入DNA保存液中并置于冰盒内，于30 min内转运至-80 ℃冰箱长期储存。

1.6 血液样本收集于患者入院后第二天采集血液样本。用EDTA抗凝采血管采集3～5 mL外周静脉血，随后将血样带回实验室于高速冷冻离心机4 ℃、3 000 r·min-1离心5 min，用移液器分别将血清、血细胞转移至无菌无酶EP管，放置于-80 ℃冰箱长期储存。

1.7 胃镜样本收集与胃镜室及病理科负责人沟通联系，收集行上消化道内视镜检查的患者细胞刷及活检样本。于内视镜探测时，从内视镜活检孔道依次将两根一次性内镜细胞刷插至食管癌黏膜正常及病变处，擦拭4～5次后将细胞刷退出，折断刷头放入DNA保存液中，密封。再将两根一次性活检钳沿内视镜活检孔道依次插至距食管癌黏膜病变部位上方>5 cm食管正常黏膜及食管黏膜病变处，钳取2～3块组织，退出活检钳后，将组织分别放入已装有无液氮组织RNA保护液(德国QIAGEN)的EP管中并置于冰盒内，于30 min内转运至-80 ℃冰箱长期储存。

1.8 手术样本收集与手术室及病理科负责人沟通联系，收集行食管癌根治术的患者所切除的食管标本中部分病变及正常黏膜组织。于距病变5 cm以外处，分离食管黏膜组织，放入已装有DNA、RNA保护液的无菌无酶EP管中并置于冰盒内。选取病变部位中心及边缘处各取2块，放入已装有无液氮组织RNA保护液的无菌无酶EP管中，置于冰盒内，于30 min内转运至-80 ℃冰箱长期储存。

1.9 样本预处理及质量控制随机对入库样本进行抽样，利用液氮研磨法提取RNA，经紫外分光光度计测定A260 nm与A280 nm下的OD值以判定RNA纯度，比值越接近2则代表RNA纯度越高[8-9]。定期对样本质量及样本信息的完整性进行抽检，并根据抽检结果适当调整样本采集、转运及储存方法。

2 结果

2.1 样本库基本信息样本库自2016年9月至2020年5月于河南科技大学第一附属医院及安阳市肿瘤医院共计收集164例食管癌患者活检及285例手术样本，每例样本均具有配套口腔、血液样本以及临床病理资料。见表1。

表1 样本库临床病理资料及一般特征 例(%)

2.2 样本质量控制每季度对入库样本随机进行RNA抽提，经紫外分光光度计测定纯度并记录。每季度对上季度抽检样本进行复检，与首次提取对比后判定样本质量(图1)。如差值较大，则及时对样本采集、转运及储存方法进行适当调整。

图1 随机抽检样本库RNA纯度

3 讨论

河南省作为我国食管癌高发区，在食管癌相关的流行病学调查、早期筛查、病因学及治疗方面展开了大量的研究。由于缺乏有效的预防及筛查方法，食管癌患者往往在确诊时已处于中晚期，其5 a生存率不足20%[10]，通过构建高发区食管癌生物样本库为食管癌病因学研究提供一个稳定可靠的样本基础十分必要。河南食管癌高发地区人口众多且人员流动性较小，为在当地展开流行病学调查提供了便利[11]。本课题组通过深入河南省食管癌高发区林州市进行流行病学调查，发现牙齿缺失与食管癌发生发展呈正相关[4]。而一种口腔条件致病菌Pg感染则正是口腔微生态失衡及牙周炎的重要致病菌，目前已有大量研究证实细菌感染与多种肿瘤的发生发展有关，如幽门螺旋杆菌与胃癌、肺炎衣原体与肺癌、人乳头状瘤病毒与宫颈癌等[12]。经过进一步调研发现高发区食管癌患者的Pg感染率高达61%，且与其分化程度、淋巴结转移、TNM分期、生存率降低密切相关[4]。随后通过体外细胞及体内动物实验进一步从免疫学、自噬以及小RNA角度展开其致病机制的研究[6-7,13-15]，为食管癌早期筛查及临床防治策略的制定提供了重要的理论依据。生物样本库作为临床与基础研究互相转化的重要桥梁，不仅能够将临床样本及信息资源的利用最大化，还能为临床诊治提供重要的理论依据[16]。样本库中组织及血液样本主要用于PCR、Western blot、ELISA、组织芯片、免疫组织化学等基础实验，口腔拭子及内镜下细胞刷样本可进一步经测序后用于转录组及代谢组分析，临床病理资料则用于统计学分析，随访资料可用于疾病进展及生存分析。自该生物样本库建立至今，累积为30余项科研项目提供样本支持，其中包括国家自然科学基金面上项目3项，在SCI收录研究论文20 余篇，累积影响因子>60。

河南科技大学第一附属医院及安阳市肿瘤医院服务于食管癌高发区人群，在构建食管癌生物样本库方面有着先天地理及人口优势，通过与两院临床科室、内镜室、手术室、病理科、科研科及医务科等多方沟通协调，开展以口腔、组织、血液样本为主的生物样本库构建。在样本采集、转运及长期储存方面，制定了严格的质量控制体系，运用了大量辅助设备为生物样本库的稳定可靠提供保障，并加以科学的管理方案及出入库制度，为洛阳和安阳两地的食管癌基础研究及临床应用提供了稳定可靠的基础资源。

综上所述，该食管癌生物样本库建立了完善的样本采集、转运及储存方案，配备了科学的管理制度，为有效利用食管癌高发区病例资源，推动食管癌病因学研究提供了坚实可靠的基础资源。