DNA 甲基化在风湿性疾病研究进展

姚心怡 陆定其 冯 波 陈丽莹 何诗雅 王新昌

风湿免疫疾病泛指影响关节、骨骼、肌肉、神经、血管及有关软组织或结缔组织，在遗传及表观遗传学、环境等多种因素共同作用下导致免疫系统功能紊乱的一类自身免疫性疾病。目前对风湿性疾病的发病机制仍缺乏深入认识。风湿性疾病早期诊断困难，精准治疗已经成为风湿病疾病治疗的远大前景，虽有一些靶向药物上市，但仍缺乏廉便有效的根治手段。DNA 甲基化（DNA methylation）作为DNA 化学修饰的一种形式，能通过影响DNA 构象、DNA 稳定性及染色质结构等过程影响基因表达。DNA 甲基化大多发生在基因启动子区CpG 岛上，基因启动子区的DNA 甲基化可抑制基因转录。系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）、干燥综合征（Sjgresyndrome，SS）、类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是临床最具有代表意义的风湿性疾病，本文就DNA 甲基化在这三种疾病的发病机制、临床特征以及药物治疗反应三方面的作用，综述如下。

1 DNA 甲基化

DNA 甲基化是存在于真核细胞中的一种普遍的修饰方式，也是哺乳动物基因表达调控的主要表观遗传学形式，其在胚胎发育、染色质重塑、基因转录、基因印迹、X 染色体失活等众多过程中都发挥着关键作用。DNA 甲基化是指由DNA 甲基转移酶（DNA methyl transferase，DNMT）介导，从S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）到CpG 二核苷酸中胞嘧啶残基的碳5 位置的甲基转移，生成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）的过程。DNA 甲基化过程由DNMT3 建立，并在细胞分裂过程中由DNMT1维持。通常认为基因启动子区域中的甲基化CpG 位点通过与甲基胞嘧啶结合蛋白（如甲基CpG 结合域蛋白1、甲基CpG 结合域蛋白2 和甲基CpG 结合蛋白2 等）结合而干扰基因转录，又称“基因沉默”，DNA 甲基化可抑制基因转录，而DNA 去甲基化则激活基因的表达。10 -11 易位（Ten -Eleven -Translocation，TET）蛋白可将DNA 胞嘧啶5 位碳的甲基氧化生成羟基，从而催化5-mC 羟基化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC）[1]。在胸腺嘧啶DNA 糖基化酶（thymine DNA glycosylase，TDG）和去甲基酶的共同作用下，5-hmC 可逆转5-mC 修饰。此外，甲基化修饰也是蛋白质翻译后修饰的一种形式，组蛋白的甲基化与去甲基化变化能通过干预染色质结构改变、DNA 的转录过程，对炎症因子的产生、免疫环境的失衡造成影响。组蛋白是负责维持染色质结构的重要蛋白质，并在基因的动态和长期调控中发挥作用。一般认为，组蛋白修饰与基因的激活与抑制均有关系，例如：H3 赖氨酸4（H3 Lysine 4，H3K4）的甲基化是活跃转录DNA 的标志，而H3 赖氨酸9（H3 Lysine 9，H3K9）的甲基化与抑制基因表达有关[2]。上述的甲基化修饰方式不改变基因序列而参与调控基因表达，具有一定的稳定性与动态性，因而能使真核细胞生物能在遗传和环境的共同作用下参与疾病的发生和进展。

2 DNA 甲基化揭示风湿性疾病发病机制

2.1 DNA 甲基化与SLE 发病机制 SLE 是一种可累及全身多系统的慢性难治性自身免疫性疾病，好发于育龄期女性。DNA 甲基化与SLE 疾病发生和维持相关，基因启动子甲基化被提议作为SLE 的生物标志物[3]。

研究证明，DNA 甲基化抑制药物如普鲁卡因胺、肼丙嗪能诱发野生型小鼠狼疮样疾病[4]；几项全基因组DNA 甲基化研究发现，SLE 患者存在整体DNA甲基化缺陷，且Ⅰ型干扰素（interferon，IFN）信号相关基因的差异甲基化在SLE 发病中具有重要意义。Busche 等[5]对健康对照和SLE 患者外周血单个核细胞进行全基因组DNA 甲基化分析，发现85%的CpG位点在SLE 中低甲基化，其中几种主要的IFN 相关基 因 如 下 ：MX1、IFI44L、PARP9、DTX3L、IFI44、PLSCR1、IRF7、IFIT1 和RSAD2。除幼稚CD4+T 细胞外，IFN 相关基因在SLE 患者记忆、幼稚和调节性T细胞中均表现出显著的低甲基化[6]。另有研究表明，SLE 患者B 细胞中IFN 相关基因低甲基化状态与早期B-细胞因子1（recombinant early B-cell factor 1，EBF1）重组蛋白结合CpG 位点的作用相关[7]。SLE差异甲基化的基因在先天免疫系统、FasL/CD95L 信号转导通路、中性粒细胞脱颗粒等生物学过程中富集，差异甲基化基因与风险基因单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNPs）关联分析发现了7 个与SNPs 关联的基因座：CD45、MHC-ClassIII、UHRF1BP1、IRF5、IRF7、IKZF3 和 UBE2L3，由此推测SLE 风险位点变异可能通过基因调控区的DNA 甲基化改变来影响疾病表型[8]。

2.2 DNA 甲基化与SS 发病机制 SS 是一种侵犯全身外分泌腺，伴有多系统损害的慢性自身性免疫性疾病。Altorok 等[9]首次报道SS 的表观基因组关联研究结果，发现在SS 患者CD4+T 细胞中主要是淋巴毒素α（lymphotoxin-alpha，LTA）和IFN 诱导基因相关位点发生低甲基化，并且编码溶质载体蛋白的基因如SLC11A1、SLC11A2、SLC22A23、SLC25A25 等也呈现低甲基化状态。美国俄克拉荷马大学健康科学中心发现，与SS 最相关的基因遗传座存在于主要组织相容性复合体/人类白细胞抗原（major histocompatibility complex/human leukocyte antigen，MHC/HLA）区，且与IRF5、BLK、IL12A、TNIP1、CXCR5 等基因密切相关，证明SS 的发病与B 细胞活化、通过IFN 的先天免疫系统激活、HLA 敏感性和IL-12-IFNγ 轴反应相关[10]。与此对应，在Miceli-Richard 等[11]的研究中发现，在SS 患者CD19+B 细胞中IFN 诱导基因位点差异甲基化最为显著，这也进一步佐证了通过IFN的先天免疫系统的激活是SS 的主要发病机制之一。对SS 患者外周血全基因组DNA 甲基化进行的研究，同样观察到IFN 诱导的基因如MX1、IFI44L、PARP9 和IFITM1 等位点存在明显低甲基化，且TNFRSF10A、IRF8、CXCR5、LTA、SOCS1、TNF、BCL2、PSMB2 和PIK3CD 等基因位点差异甲基化与淋巴瘤有关[12]。Cole 等[13]对SS 患者的唾液腺进行了全基因组DNA 甲基化研究，发现了LTA 基因的低甲基化，这与Altorok 等[9]对外周血全基因组甲基化分析的结论相互印证，提示我们LTA 在SS 发病过程中的潜在作用，LTA 可能是SS 研究的新靶点。

此外，一些针对SS 具体基因位点DNA 甲基化状态的研究也为我们提供了许多有意义的参考。Yu等[14]发现SS 患者CD4+T 细胞FOXP3 启动子区CpG位点DNA 甲基化水平显著增高，且与FOXP3 mRNA 及蛋白表达呈负相关，FOXP3 启动子区域位点甲基化水平升高可使FOXP3 表达降低，从而促使调节性T 细胞（regulatory cells，Treg）发育受损，进而可能在发病中起重要作用，揭示了细胞免疫与DNA 甲基化的潜在关系。

2.3 DNA 甲基化与RA 发病机制 RA 是一种侵蚀性、进行性破坏关节的慢性系统性疾病。RA 患者外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）、B 细胞、T 细胞等都表现出甲基化状态的改变[3]。差异基因在T 细胞共刺激、IFN-γ 介导的信号通路和T 细胞受体信号通路等途径富集，分析蛋白质相互作用后发现了包括MX1、ISG15、IFI44L、DTX3L、PARP9 和STAT3 等在内的干扰素互作网络，这提示我们同SLE、SS 一样，IFN 相关基因及通路在RA 发病中也占有较为重要的地位。无独有偶，Chen 等[15]对RA 患者CD4+T 细胞全基因组DNA 甲基化进行了研究，发现IFN 相关基因如IFIT1、IRF7、MX1、OAS1、USP18、RSAD2 等与对照组相比存在显著差异甲基化。IRF5 作为干扰素调节因子家族之一，参与了Toll 样受体信号通路，在急慢性炎症过程中具有重要作用，IRF5 的单核苷酸多态性与RA 的疾病易感性相关，且在RA 患者中存在IRF5 启动子区低甲基化状态[16]，这提示我们IRF5 启动子区的甲基化状态可作为RA 的潜在标志物。

除外周血的DNA 甲基化研究外，还有一些研究专注于RA 患者滑膜细胞的DNA 甲基化改变。Ai等[17]对RA 患者成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）的全基因组DNA 甲基化、RNA 转录、染色质进行了综合分析，差异基因提示Huntingtin 信号通路在RA 发病中具有重要作用，并且发现参与网状蛋白介导的内吞作用和细胞信号转导的Huntingtin 相互作用蛋白1（huntingtin interacting protein 1，HIP1）能够调节RA 的FLS 对基质的侵袭。Ham 等[18]发现在RA 患者的滑膜细胞中，差异甲基化基因涉及GLI1、RUNX2 和TFAP2A/C 等，与创伤反应、组织发育、胶原纤维组织和转化生长因子-β受体信号通路相关。由此可见，DNA 甲基化能够参与调控RA 靶组织中滑膜细胞的损伤、修复过程，从而影响RA 的疾病发生。

3 DNA 甲基化与风湿性疾病临床特征

3.1 DNA 甲基化与SLE 临床特征 SLE 的DNA 甲基化状态与临床特征、疾病活动度有关。SLE 具有较高的异质性，在不同种族人群中具有明显差异。一项将非裔美国人与欧洲裔美国人进行比较的研究确定了原始CD4+T 细胞中DNA 甲基化模式的种族特异性[5]，种族差异的甲基化可能与我们临床观察到的SLE 不同种族的发病率、结局和疾病表现的差异有关。DNA 甲基化与SLE 发病的环境因素也密切相关。阳光的照射可诱发SLE 病情活动，暴露在紫外线、香烟烟雾、二氧化硅和其他压力源等环境中会刺激活性氧的产生，进而通过破坏MAPK/ERK 途径而导致SLE 患者T 细胞中DNMT1 失调和整体DNA脱甲基[19]。SLE 患者差异甲基化基因如TNK2、DUSP5、MAN1C1、PLEKHA1、IRF7、HIF3A、IFI44 和PRR4 与狼疮性肾炎相关；IFIT1、IFI44L、MX1、RSAD2、OAS1、EIF2AK2 和RABGAP1L 与更高的疾病活动性和肾脏疾病以及自身抗体的产生有关[20]。同时，狼疮患者的DNA 甲基化图谱可以区分不同皮损表现和器官的受累情况[21-23]，如颧部皮疹与盘状皮疹，肾脏与非肾脏受累，关节与非关节受累等。DNA 甲基化改变与临床表现的特异性相关，这提示我们特定基因甲基化状态可能成为诊断标志物和治疗的新靶标。

3.2 DNA 甲基化与SS 临床特征 DNA 甲基化变化与SS 疾病活动和进展、疾病流行和严重程度的人群差异相关。研究发现，在抗SSA 和/或抗SSB 抗体阳性的SS 患者中，IFN 诱导基因的低甲基化更明显[11-12]，并且基因位点的DNA 甲基化水平与ESSDAI 评分密切相关，高ESSDAI 评分患者与低ESSDAI 评分患者相比，DNA 甲基化差异更为显著。慢性疲劳在具有相同疾病和疾病活动的个体之间差异很大，可能与基因序列或遗传调控因素发生变化有关。Norheim 等[24]通过研究高疲劳和低疲劳SS 患者的单核苷酸多态性变异来探究DNA 甲基化在SS 患者疲劳中的可能作用，研究发现高疲劳状态SS 患者与SLC25A40 基因DNA 甲基化水平具有更高的关联度。Braekke Norheim 等[25]也对此进行了研究，发现高疲劳与低疲劳SS 患者之间的差异甲基化位点，与参与调节免疫应答的活化T 细胞核因子（nuclear factor of activated Tcells，NFAT）、T 淋巴细胞磷脂酶C 及IL-1 通路中参与Nur77 信号传导的基因相关。这些结果揭示了先天免疫系统和适应性免疫功能与SS 患者疲劳表现具有一定的关联。Karagianni 等[26]发现，SS患者唾液腺H19 位点印记控制区的DNA 甲基化减少，并与C4 血清补体水平呈负相关，由此我们推测H19ICR 基因DNA 甲基化水平可以作为监测SS 的一个表观遗传学标记。

3.3 DNA 甲基化与RA 临床特征 RA 的疾病过程与环境风险、遗传风险的叠加作用相关，而DNA 甲基化在其中具有潜在的调节作用。一项基于瑞典RA患者的研究显示，MHC 区域的cg21325723 位点DNA 低甲基化水平与抗抗环瓜氨酸（anti-cyclic peptide containing citrulline，CCP）抗体阳性RA 发生的风险增加相关[27]。环境风险因素如吸烟等对该位点的DNA 甲基化水平有一定的影响。同时，RA 风险基因位点rs6933349 转录水平受到cg21325723 位点DNA 甲基化水平调控。DNA 甲基化的动态变化贯穿RA 疾病过程，与RA 患者疾病活动评分、RA 关节损害评分、sharp 评分、病程等因素相关。研究表明，双特异性磷酸酶 22（dual -specificity protein phosphatase 22，Dusp22）启动子区DNA 甲基化水平与RA 患者的糜烂性疾病改变相关；细胞色素P450家族2 亚家族E 成员1（recombinant cytochrome P450 2E1，CYP2E1）启动子区DNA 甲基化水平与RA 疾病活动度相关[28]。Ai 等[29]对RA 患者膝关节和髋关节的DNA 甲基化进行了研究，发现IL-6 信号传导途径相关基因位点存在显著差异甲基化，且验证后表明RA 髋关节中IL-6 的表达比膝关节高10.8倍，这提示IL-6 通路相关基因位点的DNA 甲基化水平可能有助于区分RA 的发病部位。

4 DNA 甲基化与风湿性疾病药物治疗反应

DNA 甲基化的动态变化与风湿性疾病的药物治疗反应存在一定关联。一项混合性结缔组织病全基因组DNA 甲基化研究发现，在PARP14、SPATS2L、DDX58、OAS2、PLSCR1、HLA-F、LGALS3B 基因位点上存在与免疫抑制剂治疗相关的差异DNA 甲基化表现[30]。另有研究发现，在SLE 患者中存在与糖皮质激素、硫唑嘌呤治疗有关的CpG 位点[20]，在肿瘤研究领域，已有部分研究开展对靶向药物疗效与DNA 甲基化相关性的探索，而目前对风湿性疾病治疗药物和DNA 甲基化的研究稍显不足。就现有的研究结果来看，某些特定基因位点的DNA 甲基化的状态，可能是预测临床疗效、制定更为合理的治疗方案的潜在指标。

5 展 望

风湿性疾病的诊断和治疗有效性仍是现阶段面临的难题。各种风湿性疾病独特的DNA 甲基化图谱在一定程度上能够为诊断提供新指标。多种风湿性疾病均存在IFN 相关基因低甲基化这一共性，提示风湿性疾病类似的发病机制，同时调节IFN 相关基因甲基化状态可能成为未来治疗的新思路；基于DNMT 等甲基化相关蛋白作用，我们推测未来使用DNMT 活性调节剂治疗风湿性疾病具有一定的可行性；风湿性疾病临床表现、药物治疗与DNA 甲基化动态变化之间的联系也为疾病发展、预后和疗效预测等方面的研究提供了新参考。目前DNA 甲基化与风湿性疾病的研究有待进一步发展，汉族人群的DNA 甲基化图谱研究仍相对欠缺，期待在不远的将来能涌现更多的相关研究，为风湿性疾病的临床诊断、治疗和预后提供更多的表观遗传学依据。