内质网应激及蛋白激酶R样内质网激酶/CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白/门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12信号通路介导的细胞凋亡在糖尿病肾病发病机制中的作用研究进展

李 蓉，宋宗良，张效科，武宁静，游清啸

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学附属医院内分泌科，陕西 咸阳 712000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是由糖尿病导致的慢性肾脏损伤，临床上以血糖升高、蛋白尿、肾小球滤过率下降为特征，引起的病理改变包括肾小球基底膜增厚、足突融合、细胞外基质沉积等[1]。DN发病机制复杂，高血糖、内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、氧化应激、病毒感染、炎症因子、遗传突变、凋亡自噬等均可导致其发生，其中ERS介导的细胞凋亡在DN病程进展中发挥关键作用。ERS是机体面对多种刺激因素和损伤因子进行适应环境的自我调整，适度的ERS有益于细胞内环境的修复与稳定，是机体正常运行的重要条件。但持久且过度的ERS会破坏细胞内环境，影响内质网正常功能，进而诱导细胞进入凋亡状态，对组织器官造成实质性损害。越来越多研究表明，ERS、细胞凋亡与DN的病程发展密切相关，其中蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)/CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT enhance-binding protein homologous protein,CHOP)/门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12(cysteine-containing aspartate-specific proteases-12,caspase-12)信号通路是ERS诱导肾脏细胞凋亡的重要途径，通过抑制该通路可以保护肾脏，延缓DN的发病进程。本文就ERS、细胞凋亡及PERK/CHOP/caspase-12信号通路在DN发病机制中发挥的作用进行综述。

1 ERS介导的细胞凋亡与DN

1.1 细胞凋亡在DN疾病进展中的作用细胞凋亡在DN、阿尔茨海默病、癌症等疾病的进展中发挥着重要作用，生理状态下凋亡具有维持机体内环境稳定作用，在各种病理因素刺激后诱发凋亡因子，诱导正常细胞发生凋亡，导致DN等疾病的发展[2]。凋亡是高等真核生物中一种主动程序性细胞死亡的过程，是通过体积减少、细胞表面起泡、染色质DNA的缩合、核小体间裂解和凋亡小体的形成最终完成的，是对应激环境的一种应答反应[3]。细胞凋亡和细胞增殖相互作用制衡，共同调控机体组织发展的进程[4]。研究发现，caspase是细胞凋亡的主要分子，其介导的细胞凋亡途径可分为线粒体途径、死亡受体途径、颗粒酶B途径，而现新发现的ERS介导的凋亡途径在大多数应激的真核细胞内都存在，并在DN、心血管疾病、肿瘤等疾病的病程中发挥作用[5]。随着对分子生物学认识的逐渐深入，多数学者认为ERS及其介导的细胞凋亡是引起DN发生、进展的关键机制之一[6]。在DN的病程进展中，血糖升高、蛋白尿、炎症等持续应激可影响内质网稳态，出现ERS，其通过刺激细胞内凋亡信号(如PERK/CHOP信号通路)增加促凋亡分子的表达，活化caspase分子，最终诱导肾脏细胞凋亡，引起肾脏病理学改变，肾功能下降[7]。魏静等[8]研究发现，DN小鼠肾小球滤过率降低的关键原因是ERS介导的肾脏细胞凋亡。因此，研究导致细胞发生凋亡的刺激因素、通路等是非常有必要的。

1.2 ERS在DN病程中的作用肾脏的各种类型细胞普遍具有内质网系统，DN患者在血糖升高或波动过大以及出现大量蛋白尿时易触发ERS，当机体处于过度ERS时会导致肾脏细胞凋亡、损坏肾脏结构，进而加速DN的进程，从而形成恶性循环[9]。ERS是指由于错误折叠或未折叠的蛋白质大量堆积，细胞为维持其正常功能而触发的一系列效应。未折叠蛋白反应(unfolded protein reaction,UPR)信号通路作为ERS的主要通路，是目前的研究热点，UPR信号通路由PERK、肌醇需求酶 1(inositol requiring enzyme l,IRE1)-α、激活转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)及内质网跨膜感受蛋白所介导[10-11]。其中PERK的功能主要是降低细胞内蛋白质翻译，减少内质网中新合成的蛋白质，IRE-l、ATF6的主要功能是增加内质网中伴侣基因表达，下调大量错误蛋白的折叠和降解，提高蛋白折叠能力；UPR通过上调伴侣基因分子的表达、清除相关蛋白质、阻断蛋白质合成等综合作用维持内质网稳态[12]。但随着ERS持续时间和强度的增加，UPR的作用从维持内质网稳态从而保护细胞转变到促进细胞凋亡[13]。有研究发现，适度的应激能够促使UPR上调抗凋亡分子的表达和抑制蛋白合成，恢复内质网正常功能，开启细胞保护机制；但持续强刺激则引起UPR起到相反作用，上调凋亡分子的表达，使得肾脏细胞凋亡，导致DN的发生和进展[14]。研究表明，敲除ERS的关键基因TRB3会加重DN患者的蛋白尿[15]。在DN中，ERS可通过调控活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成来减轻氧化应激反应，从而保护肾脏。

ERS主要通过以下机制在DN病程进展中发挥作用:(1)干预细胞凋亡。DN病情加重的原因之一是过度ERS介导的肾脏细胞凋亡可损伤肾脏结构及功能。既往研究发现，血糖升高触发的ERS经过CHOP信号通路传导促使大量肾脏细胞凋亡，从而导致DN发生[16]。但也有研究发现，ERS可以上调抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤蛋白2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表达，抑制肾脏细胞过度凋亡，从而发挥维持肾脏正常功能的作用[17]。(2)调节氧化应激。大量的ROS自由基为ERS及UPR的激活而堆积在细胞中，触发氧化应激反应,引发炎症，激活PERK/CHOP/caspase-12等多种信号通路，成为DN的发病基础。CAO等[18]研究证实，使用ERS抑制剂可减少足细胞发生氧化应激，从而减轻肾脏损伤，保护肾脏功能。(3)调节炎症反应。未折叠蛋白和晚期糖基化产物及其受体的大量累积可介导ROS的产生，导致ERS，从而引发肾脏炎症，提示DN中ERS诱导的炎症反应是导致其病情进展的因素之一。CHOP是ERS细胞抗炎症反应的关键因子，有研究显示，小鼠CHOP基因敲除后，肾脏炎症反应加重[19]，提示ERS可通过CHOP通路发挥抗炎作用，保护肾脏，证实了ERS可以调节DN肾脏炎症反应。(4)调节自噬。ERS通过UPR通路介导的PERK、ATF6、IRE1-α蛋白或Ca2+释放浓度等调节自噬[20]。研究发现，在DN小鼠出现持续ERS时，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和ATG5基因表达降低，同时PERK的下游转录因子CHOP 的表达上调，肾脏损伤加重，提示DN病程中高强度的ERS会抑制自噬，从而导致肾脏细胞凋亡[21]。

以上研究表明，在DN病程中ERS的激活是一把双刃剑，在ERS初期可以通过处理错误或未折叠的蛋白质维持肾脏的正常功能；但在高血糖、炎症等各种因素长时间的刺激下，ERS增强，UPR被过度激活，肾脏细胞的结构和功能被破坏，引发细胞凋亡程序，当细胞大面积发生凋亡，细胞数量急剧下降，就会出现该器官功能减退。综上所述，ERS不仅是细胞自我保护，抵抗外界刺激的主要手段，还是在持续刺激下致使机体细胞损伤、凋亡的机制之一。因此，探究如何把握ERS在DN病程进展中是发挥保护功能还是促凋亡功能显得尤为重要。

2 PERK和CHOP介导的细胞凋亡与DN

随着人们对DN分子体系认识的深入探索，许多促进细胞凋亡的分子开始作为治疗DN的新方向。其中，ERS中PERK/CHOP/caspase-12信号通路诱发的凋亡被认为是DN病程进展的关键。由于ERS具有双重功能，UPR作为ERS的主要通路，能够通过PERK、IRE-1和ATF6来影响细胞中蛋白质内转录和翻译，以减轻ERS。内质网维持稳态时，葡萄糖调节蛋白 78 (glucose regulated protein 78,GRP78)/免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein,BIP)与PERK、IRE-1、ATF6蛋白分别结合，为失活状态，当机体发生ERS时，这3种蛋白与GRP78/BIP解离，成为激活状态，并分别诱导下游信号的传导和基因的表达。因此，在高血糖等各种因素的不断刺激下，肾脏细胞出现持续ERS时，下游CHOP、caspase-12等促凋亡转录因子被诱导活化，细胞开启凋亡程序，肾脏结构遭到破坏[22]。

PERK产生的调节效应是UPR中最早也是最重要的一部分，是通过介导一系列基因的表达，在源头上抑制错误蛋白质的合成，在应激初期提高机体对抗ERS所形成的损害。研究发现，当细胞中存在较多未折叠的蛋白时，与PERK结合的GRP78自动与其分离，转而与未折叠蛋白相结合，PERK则被激活，通过磷酸化真核细胞起始因子2α(eukaryotic initiationfactor 2α,eIF2α)抑制蛋白质合成，并阻止新合成的蛋白质在内质网中不断加载，这种抑制作用对于维持细胞存活和代谢稳态非常关键[23]。由此可见，ERS早期可通过降低蛋白质的合成能力，减弱内质网中蛋白质的合成，提高细胞应对环境中刺激因素的能力，维持细胞内部稳态，从而抑制DN的发生和发展。磷酸化的eIF2α也会增加激活转录因子4(activating transcription factor 4，ATF4)的翻译，ATF4的增加能够促进细胞凋亡相关因子CHOP的表达，如果此时内质网未被修复，仍然处于过度应激状态时，PERK/ATF4/CHOP通路被激活，诱导细胞发生凋亡[24]。HUANG等[25]在DN发病机制研究中的结果与上述研究一致。由此可知，过度持续的ERS使得UPR的自我适应能力下降，导致细胞不可逆受损，诱导细胞凋亡[26]。过多细胞的损伤、凋亡可引起肾脏结构及功能发生严重损害，包括肾小球硬化、肾小球滤过功能下降、尿蛋白增多等，从而加剧DN病程的进展。PERK的激活和eIF2α的磷酸化被认为是ERS激活的标志。

CHOP是ERS的促凋亡蛋白之一，其在正常情况下一般呈低表达，但ERS激活后PERK可显著上调前凋亡基因 CHOP 的转录[27]。CHOP可下调抑凋亡蛋白Bcl-2表达，并上调促凋亡蛋白相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax) 的表达，进而活化caspase家族蛋白，诱导细胞发生凋亡[28]。陈玉凤等[29]研究发现，增加DN小鼠肾脏中PERK、GRP78的表达可激活CHOP基因转录，导致肾脏结构改变，而在敲除CHOP基因后，肾脏之前发生的改变较前好转，减慢了肾脏病变进程，表明了CHOP诱导的肾脏细胞凋亡是DN病程进展的关键。也有研究发现，低血糖、高血糖，特别是血糖波动诱导肾小球系膜细胞内的PERK/CHOP 通路激活，会导致细胞过度死亡，加快DN的进程[30]。提示CHOP是机体由早期抵抗细胞凋亡到促进细胞凋亡过程的关键信号蛋白，能够调控细胞凋亡进程，因此，阻断CHOP介导的细胞凋亡，从而逆转ERS诱导的DN，将是DN治疗的潜在靶点之一[31]。

综上可知，导致DN进展的关键因素是肾脏细胞发生ERS后，PERK的激活和CHOP的持续高表达，使得Bax持续作用，从而促进肾脏细胞发生凋亡。

3 caspase-12介导的细胞凋亡与DN

Caspase家族蛋白同源性较高，结构相似，均具有N-端的半胱氨酸激活位点及底物裂解位点。目前已知晓的caspase系列蛋白酶有14种，根据其在凋亡调节中作用的不同分为炎症介导因子(如caspase-1、caspase-4、caspase-5、caspase-11、caspase-12、caspase-13、caspase-14)、凋亡启动因子(如caspase-2、caspase-8、caspase-9、caspase-10)和凋亡执行因子(如caspase-3、caspase-6、caspase-7)。

其中caspase-12是内质网外膜上的蛋白质之一，其在膜受体和通路中不能被启动，是ERS特殊的凋亡通路，作为DN病程中导致肾脏细胞凋亡的关键蛋白通过活化 caspase-9和 caspase-3介导肾脏细胞凋亡，并且能够对ERS相关凋亡产生促进作用。而肾脏细胞的凋亡是致使DN发生、发展的主要原因。caspase-3作为细胞凋亡过程中的主要凋亡执行因子，其活化是凋亡进入不可逆阶段的一个重要特征[32]。研究发现，CHOP与caspase-12之间具有关联性，CHOP 蛋白过表达可促进caspase级联反应，释放活性caspase-12，最终导致细胞发生凋亡[33]。GUO等[34]研究发现，不对称性二甲基精氨酸能够激活肾脏细胞的PERK 和IRE1α途径，诱导CHOP的表达,从而激活下游的促凋亡信号途径，使得Bax作用加强，Bcl-2作用减弱，诱导caspase-12的活化，从而促进肾脏细胞凋亡，加快DN病程进展。caspase-12作为在ERS介导细胞凋亡中的关键蛋白，直接诱导肾脏细胞发生凋亡，加重DN进程。综上可知，PERK、CHOP、caspase-12三者之间构成了上下游的信号转导通路，DN患者在高糖等各种刺激下，肾脏组织被过度激活ERS，随后PERK开始发挥作用，并且增加CHOP表达，而CHOP又可调控caspase-12的活化，从而介导肾脏细胞凋亡，导致DN的进展。可根据DN发病机制中ERS诱导细胞凋亡的特点，采用相应的干预方法缓解过度的ERS，抑制其凋亡途径，将会有效地遏制DN的发生和发展。

4 结语

在DN病程中，严重及长期的ERS可导致肾脏细胞凋亡，是引起肾脏损伤的关键，其中PERK/CHOP/caspase-12信号通路是介导细胞凋亡的主要通路。因此，可通过阻断该通路，抑制细胞凋亡，保护肾脏功能，延缓DN的进展。但目前对ERS介导的细胞凋亡途径未完全明确，需要继续深入研究，以期为临床从信号转导途径防治 DN 的治疗研究提供参考与理论支持。