妊娠期糖尿病患者血清微RNA-372-3p和葡萄糖转运蛋白4水平与胰岛素抵抗的关系

袁德丽,周 清，傅晓冬

(西南医科大学附属医院产科，四川 泸州 646000)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes，GDM)是妊娠期常见疾病，血糖升高不仅会导致围生期母婴不良结局，还会导致子代成年后代谢紊乱，给孕妇及子代造成严重影响[1-2]。胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是GDM主要的发病机制，寻找IR相关靶点，对改善母婴结局和子代成年后代谢紊乱具有重要意义[3]。微RNA(microRNA，miRNA)是一类可调控细胞增殖、分化、凋亡、侵袭等生物学行为的非编码RNA。近年研究表明，miRNAs在胰岛素合成、分泌、信号传导等过程中发挥重要作用[4]。李伟等[5]通过分析GDM患者与健康孕妇胎盘组织中差异性表达miRNAs发现，miR-372-3p在GDM患者胎盘组织中呈高表达。但miR-372-3p是否参与GDM患者IR尚不明确。葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)为协助葡萄糖转运的主要蛋白质，其表达下调可降低胰岛素敏感性，导致IR[6]。为进一步明确miR-372-3p、GLUT4在GDM发病机制中的作用，本研究分析了GDM患者血清中miR-372-3p和GLUT4水平的变化及二者与IR的关系，以期为GDM发病机制的研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2020年8月至2021年1月西南医科大学附属医院收治的42例GDM患者为GDM组，另选择同期42名健康妊娠妇女为对照组。病例纳入标准：(1)符合《妊娠合并糖尿病诊治指南(2014)》[7]诊断标准；(2)单胎、头位；(3)孕24～28周；(4)临床资料完整者；(5)近期未接受降糖治疗者；(6)孕妇及家属均知情同意。排除标准：(1)合并妊娠期高血压等其他妊娠并发症者；(2)自身免疫性疾病者；(3)急性炎症期者；(4)恶性肿瘤者；(5)继发性糖尿病者；(6)重要器官功能损伤者。对照组：年龄24～38(30.54±4.65)岁，孕前体质量指数18～26(22.44±1.47) kg·m-2，孕24～28(26.11±1.18)周；孕次： 1次13例，≥2次29例；产次： 0次17例，≥1次25例。GDM组：年龄24～38(29.51±4.25)岁，孕前体质量指数18～26(22.51±1.56) kg·m-2，孕24～28(26.14±1.20)周；孕次： 1次11例，≥2次31例；产次： 0次16例，≥1次26例。2组孕妇年龄、孕前体质量指数、孕周、孕次及产次比较差异无统计学意义 (P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 2组受试者代谢相关指标检测采集GDM组患者入院后次日和对照组受试者体检时静脉血6 mL，3 000 r·min-1离心10 min(离心半径8 cm)，取上清液，置于-80 ℃环境中保存。使用 BS-450 全自动生物化学分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子有限公司)检测2组受试者血清中总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)水平。采用葡萄糖氧化酶法检测2组受试者空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)水平，放射免疫法检测2组受试者空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)水平，葡萄糖耐量试验检测2组受试者餐后2 h血糖(2 h blood glucose，2 h BG)水平。计算稳态模式评估胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-insulin resistance index,HOMA-IR)和HOMA胰岛β细胞功能指数(HOMA beta-cell function index,HOMA-β)；HOMA-IR=FBG(mmol·L-1)×FING(mIU·L-1)/22.5，HOMA-β=20×FING(mIU·L-1)/[FBG(mmol·L-1)-3.5][8]。

1.2.2 2组受试者血清中miR-372-3p相对表达量及GLUT4水平检测应用TRIzol总RNA抽提试剂盒(上海嵘崴达实业有限公司)提取血清总RNA，紫外分光光度计检测浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳验证完整性。使用TaKaRa反转录试剂盒(上海研卉生物科技有限公司)将RNA反转录为cDNA，置于-20 ℃ 冰箱中保存。参照实时荧光定量聚合酶链式反应试剂盒(上海易汇生物科技有限公司)说明书配置反应体系，反应体系:10.0 μL SYBR Premix Ex Taq、0.4 μL正向引物、0.4 μL反向引物、0.4 μL ROX Reference Dye、2.0 μL cDNA模板、6.8 μL RNase-free双蒸水；反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，循环40次。miR-372-3p上游引物序列为 5′-AAAGUGCUGCGACAUUUGAGCGUGC-3′，下游引物序列为5′-UCAAAUGUCGCAGCACUUUUU-3′；内参U6上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游引物序列为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2-ΔΔCt法计算血清中miR-372-3p相对表达量。采用酶联免疫吸附法(试剂盒购自上海梵态生物科技有限公司)检测血清中GLUT4水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1 2组受试者血清中miR-372-3p相对表达量及GLUT4水平比较结果见表1。GDM组患者血清中miR-372-3p相对表达量显著高于对照组，GLUT4水平显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 2组受试者血清中miR-372-3p相对表达量及GLUT4水平比较

2.2 2组受试者代谢相关指标比较结果见表2。GDM组患者FBG、FINS、2 h BG、TC、TG水平及HOMA-IR显著高于对照组，HOMA-β显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 2组受试者代谢相关指标比较

2.3 GDM组患者血清中miR-372-3p相对表达量及GLUT4水平与代谢相关指标的相关性结果见表3。Pearson相关性分析结果显示，GDM组患者血清中miR-372-3p相对表达量与FBG、FINS、2 h BG、TC、TG水平及HOMA-IR 呈正相关，与GLUT4水平及HOMA-β 呈负相关(P<0.05)；GLUT4水平与FBG、FINS、2 h BG、TC、TG水平及HOMA-IR呈负相关，与HOMA-β呈正相关(P<0.05)。

表3 GDM组患者血清中miR-372-3p相对表达量及GLUT4水平与代谢相关指标的相关性

2.4 GDM组患者血清中miR-372-3p相对表达量及GLUT4水平与HOMA-IR的关系多元线性回归分析结果见表4。以血清中miR-372-3p相对表达量、GLUT4水平为自变量，HOMA-IR为因变量进行多元线性回归分析，结果显示，未校正其他因素时，血清中miR-372-3p相对表达量与HOMA-IR呈独立正相关，GLUT4水平与HOMA-IR呈独立负相关(P<0.05)；校正年龄、孕前体质量指数、孕周、孕次、产次等指标后，血清中miR-372-3p相对表达量与HOMA-IR 呈独立正相关，GLUT4水平与HOMA-IR呈独立负相关(P<0.05)。

表4 GDM组患者血清中miR-372-3p相对表达量及GLUT4水平与HOMA-IR相关性多元线性回归分析结果

3 讨论

GDM为危害孕妇和围生儿生命健康的常见妊娠期合并症，高血糖状态下可对孕妇和新生儿产生严重不良影响，包括死胎、胎儿畸形、早产儿、巨大儿、新生儿高胆红素血症等，威胁孕妇和新生儿生命健康，因此，了解GDM发生发展病理机制具有重要意义。目前研究认为，IR、胰岛分泌功能障碍、遗传易感性等均可能参与GDM的发生，其中IR为GDM的主要病理基础，妊娠状态下为确保以葡萄糖为主要形式的能量满足胎儿生长发育所需，母体会出现生理性IR，同时胰岛β细胞也会代偿性增加胰岛素分泌，但若IR过重和(或)胰岛β细胞代偿不足，则会引起GDM[3,9]。

miRNAs是一类由19～24个核苷酸组成的内源性单链非编码RNA，在生物体中广泛存在，主要通过与靶基因mRNA的3′非翻译区的碱基互补结合，来抑制靶基因mRNA翻译，进而调节靶基因的功能[10]。随着分子生物技术的发展，miRNAs在妇产科领域得到广泛应用，已有研究证实其可通过IR、脂肪因子、胰岛素分泌异常等途径参与GDM的发生和发展[11]。miR-372-3p位于人染色体19q13.42，既往有研究发现，2型糖尿病患者血清中miR-372-3p表达显著上调，为2型糖尿病发病独立危险因素[12]。李伟等[5]研究证实，miR-372-3p参与GDM的发生，但其在GDM中的作用机制尚不明确。本研究结果显示，GDM组患者血清中miR-372-3p相对表达量显著高于对照组，与既往报道[5]一致；GDM组患者FBG、FINS、2 h BG、TC、TG水平及HOMA-IR 显著高于对照组，HOMA-β显著低于对照组，说明GDM患者存在明显IR，胰岛β细胞功能受损，血糖血脂代谢紊乱。GDM患者因IR导致葡萄糖摄取和利用率降低，机体代谢紊乱也会影响血糖代谢。有研究发现，与非GDM孕妇相比，GDM患者患心血管疾病风险可增加1.98倍(95%可信区间为1.57～2.50)，即使未发展为2型糖尿病，未来发生心血管疾病风险也会增加1.56倍[13]。本研究还发现，GDM组患者血清中 miR-372-3p 相对表达量与FBG、FINS、2 h BG、TC、TG水平及HOMA-IR呈正相关，与HOMA-β呈负相关，说明血清中miR-372-3p水平不仅与GDM患者IR相关，还与血糖、血脂代谢紊乱相关，提示miR-372-3p可能参与了GDM患者IR过程。本研究多元线性回归分析结果表明，IR随着血清miR-372-3p水平升高而加重，但关于miR-372-3p在IR中的机制尚不明确。

研究表明，骨骼肌细胞和脂肪细胞内胰岛素信号传导障碍为IR的主要原因[14]。GLUT4是协助骨骼肌细胞和脂肪细胞葡萄糖转运的主要蛋白质。有研究表明，进食或运动后，GLUT4转运葡萄糖效率可提升1 040倍，以满足餐后血液中糖转运或向骨骼肌细胞提供能量[15-16]。曲晓洁等[17]研究发现，小鼠敲除GLUT4基因后出现明显葡萄糖耐量减退和IR。STANIROWSKI等[18]研究也显示，GDM患者胎盘组织中GLUT4表达和活性明显降低。本研究中，GDM组患者血清中GLUT4水平显著低于对照组，且其与FBG、FINS、2 h BG、TC、TG水平及HOMA-IR呈负相关，与HOMA-β呈正相关，说明GLUT4参与了GDM患者的IR过程；多元线性回归分析在校正其他因素后发现，GLUT4水平仍与HOMA-IR呈独立负相关，说明IR随着GLUT4水平降低而加重。原因可能为GDM患者发生IR后抑制了GLUT4的转位功能，不能较好地协助葡萄糖转运，导致IR进一步加重。本研究结果还显示，GDM患者血清中miR-372-3p相对表达量与GLUT4水平呈负相关。有研究通过Mireap软件预测miR-372-3p靶基因发现，GLUT4与miR-372-3p存在靶向关系，双荧光素酶基因报告证实二者为负向调控关系，抑制miR-372-3p可增强GLUT4表达，促进IR细胞糖代谢[19-20]。

综上所述，GDM患者血清中miR-372-3p相对表达量显著升高，GLUT4水平显著降低，且二者与IR独立相关，可作为GDM重要的监测指标。但本研究样本量较小，尚需多中心大样本研究证实。