临床重要细菌耐药表型分子机制、检测方法及结果解读

2022-11-26陆旻雅刘亚丽张丽徐英春

中国合理用药探索 2022年8期

陆旻雅，刘亚丽，张丽，徐英春

中国医学科学院北京协和医院检验科，侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室，北京 100730

随着抗菌药物的广泛应用，细菌耐药性问题逐渐成为临床治疗和防控感染性疾病的重大挑战，越来越多的超级细菌严重威胁着人类健康。2019年，美国疾病控制和预防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）耐药报告中将碳青霉烯类耐药不动杆菌属、碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌、耐药淋病奈瑟菌、艰难梭菌等耐药菌列入“紧急威胁（urgent threats）”[1]。本文结合美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）、欧洲药敏试验委员会（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）及我国的药敏试验相关标准，对目前临床主要细菌耐药表型的分子机制、检测方法及结果解读进行介绍[2～4]。

1 革兰阳性菌

1.1 青霉素耐药葡萄球菌属

超过90%的葡萄球菌属菌株均产生青霉素酶，多由blaZ基因编码，可水解青霉素类成份，表现为对不耐酶青霉素类抗菌药物耐药，但对耐酶青霉素类（如苯唑西林）、头孢菌素类药物敏感[5]。

当青霉素最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）≤0.12μg/ml或纸片扩散法的抑菌圈直径＞29mm时，应进一步采用青霉素抑菌圈边缘试验（仅用于金黄色葡萄球菌）、经诱导的头孢硝噻吩试验（金黄色葡萄球菌和包括路邓葡萄球菌在内的凝固酶阴性葡萄球菌）检测葡萄球菌β～内酰胺酶。β～内酰胺酶检测阴性提示菌株对青霉素类及其他β～内酰胺类抗菌药物敏感，β～内酰胺酶检测阳性则提示菌株对不耐酶青霉素类抗菌药物耐药。

1.2 甲氧西林耐药葡萄球菌

代表性菌株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin～resistantStaphylococcus aureus，MRSA），但凝固酶阴性葡萄球菌亦可出现甲氧西林耐药（methicillin～resistant coagulase negativeStaphylococci，MRCNS）。

甲氧西林耐药与细菌携带的mecA基因相关。mecA基因可编码青霉素结合蛋白2a（penicillin～binding protein 2a，PBP2a），该蛋白与β～内酰胺类药物的亲和力很低，可导致菌株产生对于β～内酰胺类药物的耐药性；携带mecA基因的菌株对青霉素类、头孢菌素类等β～内酰胺类药物均耐药，但对新型头孢菌素类药物可能敏感，如头孢洛林[6～8]。

部分mecA基因阳性MRSA菌株的体外药物敏感性试验表现为苯唑西林敏感（MIC≤2μg/ml），称为苯唑西林敏感MRSA菌株（oxacillin～susceptible methicillin～resistantStaphylococcus aureus，OS～MRSA）。有研究显示，我国OS～MRSA菌株在MRSA菌株中检出率为1.6%～1.8%，多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）主要分型为ST59型[9]；苯唑西林MIC为1～2μg/ml（敏感）时，OS～MRSA检出率高达33.3%，因此苯唑西林MIC为1～2μg/ml时易出现MRSA漏检的情况，而头孢西丁纸片法检测mecA基因阳性菌株的敏感性和特异性均较好[9]。

部分MRSA菌株mecA基因阴性，但携带另一种mec基因，即mecC基因。该基因可编码PBP2c蛋白，同样因与β～内酰胺类药物的低亲和力而导致菌株耐药[7，10]。mecC基因阳性 MRSA菌株在药敏表型上常表现为头孢西丁耐药、苯唑西林敏感[11]。

甲氧西林耐药葡萄球菌的检测方法包括：①5种表型检测方法，即头孢西丁MIC法、头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林MIC法、苯唑西林纸片扩散法及苯唑西林盐琼脂法。②可通过PCR技术检测mecA基因和mecC基因的携带情况。③乳胶凝集法检测PBP2a蛋白的敏感性及特异性均较高，但该法目前暂无法检测 PBP2c 蛋白[2～4]。

在药敏检测结果准确的前提下，对于头孢西丁筛选试验阳性或苯唑西林MIC检测为耐药的金黄色葡萄球菌，建议均报告为MRSA菌株；对于头孢西丁筛选试验阴性、苯唑西林MIC检测为敏感但范围在1～2μg/ml的金黄色葡萄球菌，建议补充头孢西丁纸片扩散法、检测mecA基因或PBP2a等检测，若结果为阳性则提示该菌株为MRSA菌株；对于凝固酶阴性葡萄球菌（除表皮葡萄球菌、施氏葡萄球菌、伪中间型葡萄球菌外），苯唑西林MIC在1～2μg/ml时为苯唑西林耐药（MIC≥1μg/ml为耐药[3]），此时需补充mecA基因或PBP2a检测，若结果为阳性方可报告为MRSA菌株。

1.3 大环内酯类-林可酰胺类-链阳菌素类（macrolide-lincosamide-streptogramin B，MLSB）耐药革兰阳性菌

MLSB指大环内酯类～林可酰胺类～链阳菌素类抗菌药物，3种抗菌药物结构不同但具有相同或重叠的靶位作用点，细菌可同时对这3类抗菌药物交叉耐药，称为MLSB耐药。

最常见的MLSB耐药机制是erm基因编码核糖体甲基化酶引起23S rRNA甲基化，导致MLSB与细菌核糖体靶位结合能力下降而产生耐药[12～13]。erm基因主要包括ermA、ermB、ermC，肺炎链球菌的MLSB耐药主要由ermB基因介导，而金黄色葡萄球菌的MLSB耐药则以ermA、ermC为主[14～16]。若erm基因稳定表达，则菌株表现为MLSB耐药。但某些情况下，erm基因需要诱导剂（红霉素等）诱导表达才能使菌株对克林霉素耐药，这类菌株在体外表现为红霉素耐药、克林霉素敏感，称为MLSB诱导表型。与甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin～sensitiveStaphylococcus aureu，MSSA）相比，MLSB诱导表型菌株在MRSA中占比更高[17]，若临床应用克林霉素可导致治疗失败[18]。因此，当葡萄球菌属、肺炎链球菌、β～溶血性链球菌的菌株表现为红霉素耐药、克林霉素敏感或中介时，需补充红霉素诱导克林霉素耐药试验（D～试验）检测MLSB诱导表型，D～试验结果阳性应报告克林霉素耐药。

1.4 青霉素耐药肺炎链球菌（penicillinresistant Streptococcus pneumoniae，PRSP）

PRSP的耐药机制主要为青霉素结合蛋白（PBPs）结构改变导致的其与青霉素亲和力降低。肺炎链球菌有6种PBPs，包括PBP1a、PBP1b、PBP2x、PBP2a、PBP2b及PBP3，其中以PBP2x、PBP2b蛋白的编码基因突变为最常见耐药类型，可导致苯唑西林耐药，而PBP2x或PBP2b联合PBP1a突变后可引起对头孢噻肟、头孢曲松的高水平耐药[19]。

对于非脑膜炎分离株，若苯唑西林抑菌圈直径≥20mm或青霉素MIC≤0.06mg/ml，提示该菌株对氨苄西林（口服或肠外制剂）、氨苄西林～舒巴坦、阿莫西林、阿莫西林～克拉维酸、头孢克洛、头孢地尼、头孢妥仑、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢洛林、头孢唑肟、头孢曲松、头孢呋辛、多利培南、厄他培南、亚胺培南、Loracarbef、美罗培南均敏感；若苯唑西林抑菌圈直径≤19mm，则该菌株可能为青霉素敏感、中介或耐药，建议进行青霉素MIC测定，同时测定头孢噻肟、头孢曲松、美罗培南的MIC。对于脑膜炎分离株，尽快应用MIC法检测并报告其对青霉素、头孢噻肟、头孢曲松和美罗培南的敏感性。

1.5 万古霉素耐药肠球菌（vancomycinresistant Enterococcus， VRE）[20]

万古霉素可与细菌细胞壁肽聚糖前体末端的D～丙氨酰～D～丙氨酸结合，抑制细胞壁肽聚糖的合成。VRE表达9种基因型：VanA、VanB、VanC、VanD、VanE、VanG、VanL、VanM、VanN，其中VanA、VanB、VanD和VanM可合成D～丙氨酰～D～乳酸，取代正常的D～丙氨酰～D～丙氨酸，降低对万古霉素的亲和力，导致菌株对万古霉素耐药。VanC、VanE、VanG、VanL和VanN则产生D～丙氨酰～D～丝氨酸而导致耐药[21]。VRE基因型检测可采用PCR；表型检测可采用纸片扩散法，检测结果为中介的菌株应进行MIC测定。不同基因型VRE的耐药表型不同。VanC型为天然耐药，携带vanC基因的鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌对万古霉素呈先天性低水平耐药；其他表型均为获得性耐药，如VanA型对万古霉素、替考拉宁高水平耐药，VanB型对万古霉素可变水平耐药、对替考拉宁敏感。

1.6 肠球菌对高水平氨基糖苷类耐药

肠球菌对氨基糖苷类的耐药性有2种，即中度耐药性和高度耐药性。中度耐药主要与肠球菌的细胞壁屏障有关，肠球菌的细胞壁较厚，氨基糖苷类药物不易穿透，但当氨基糖苷类与青霉素、头孢菌素类等抑制细胞壁合成的抗菌药物联用时可发挥协同作用，故此类菌对青霉素或糖肽类与氨基糖苷类联用敏感[20]。但有约30%的肠球菌为高水平氨基糖苷类耐药肠球菌（high～level aminoglycoside～resistantEnterococci，HLARE），其耐药机制主要是通过产氨基糖苷类修饰酶（aminoglycoside modifying enzymes，AME）或通过核糖体靶位修饰介导，对青霉素和糖肽类与氨基糖苷类联用呈现耐药，其中AME主要包括乙酰转移酶（acetyltransferases，AAC）、磷酸转移酶（phosphotransferases，APH）及核苷转移酶（nucleotidyl transferases，ANT）3 类[20]，此类菌对青霉素或糖肽类与氨基糖苷类联用耐药。

临床可选用纸片扩散法、微量肉汤稀释法或琼脂稀释法对高水平庆大霉素及链霉素耐药性进行检测。高水平庆大霉素及链霉素检测敏感株提示庆大霉素等氨基糖苷类药物与β～内酰胺类/糖肽类药物联用可有效抗菌；耐药菌株则提示上述药物联用耐药。

2 革兰阴性菌

2.1 产超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum β-lactamases，ESBLs）肠杆菌目细菌

ESBLs是由质粒介导合成，能水解青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等β～内酰胺类药物，对碳青霉烯类和头霉素类水解能力弱，可被β～内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸）抑制的一类β～内酰胺酶[22]。ESBLs主要由肠杆菌目细菌产生，常见于肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、变形杆菌。根据编码基因同源性，ESBLs可分为TEM型、SHV型、CTX～M型、OXA型和其他型[23]。

2007年以来，我国产ESBLs大肠埃希菌检出率为50%～60%，其中90%以上菌株的基因型为CTX～M型；2021年我国肺炎克雷伯菌的ESBLs检出率为 41.5%，同样以CTX～M型为主[24]。CTX～M型可分为34个亚型，不同地区、不同菌种亚型分布不同。我国接近70%的大肠埃希菌及90%的奇异变形杆菌为CTX～M～9组，超过60%肺炎克雷伯菌则以CTX～M～1组为主。基因型的不同导致菌株的耐药表型有一定差异，表现为CTX～M～1组菌株对头孢他啶、头孢吡肟和氨曲南的耐药率较CTX～M～9组菌株更高[25]。临床需报告大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌及奇异变形杆菌是否产ESBLs，其检测方法有表型筛选试验（双纸片协同试验）、确证试验（纸片扩散法、微量肉汤稀释法）。其他肠杆菌目细菌（如阴沟肠杆菌、产气克雷伯菌）也产ESBLs，但由于可能合并产头孢菌素酶（AmpC酶）而影响ESBLs检出，因此目前CLSI推荐的ESBLs表型筛选方法不适用。产ESBLs菌株感染建议选用β～内酰胺类抗菌药物/β～内酰胺酶抑制剂复方制剂或碳青霉烯类等抗菌药物治疗。

2.2 产AmpC酶肠杆菌目细菌

AmpC酶主要存在于革兰阴性杆菌中，属Ambler分类法中的C类酶或Bush分类法中的I类酶，通常由染色体介导，可导致细菌对三代头孢菌素、单环β～内酰胺类及头霉素类抗菌药物耐药，且多数不能被β～内酰胺酶抑制剂所抑制，但对碳青霉烯类及第四代头孢菌素的水解能力较弱[22]。

染色体介导的AmpC酶根据产酶水平的高低可分为诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶，而根据是否具有诱导性可分为诱导型AmpC 酶和结构型AmpC 酶。除大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌及志贺菌属外，多数革兰阴性杆菌表现为诱导高产酶，即自然状态下产酶较少、β～内酰胺类诱导下产酶量明显增加。该诱导合成依赖ampR基因调节，当其发生突变后，可导致ampC基因的持续高表达[26～27]。与之相对，大肠埃希菌的ampC基因表达不受ampR基因调节，表现为结构型低水平表达AmpC 酶[26]。AmpC 酶也可通过质粒介导，质粒介导的AmpC酶与染色体介导的结构型AmpC 酶类似，不受AmpC 酶调节基因调节，表现为持续高水平表达，主要在大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌等中检出[26，28]。

目前CLSI尚无统一的AmpC酶检测方法，可采用双纸片法、三维试验等方法检测菌株的耐药表型。对可能产生诱导型AmpC酶菌株所致感染应严格掌握头孢菌素类抗菌药物的适应症，并在治疗中监测细菌耐药性变化。

2.3 碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）

CRE是指对至少1种碳青霉烯类药物耐药（亚胺培南、美罗培南、厄他培南或多利培南）或产碳青霉烯酶的肠杆菌目细菌。碳青霉烯酶可水解碳青霉烯类在内的所有β～内酰胺类抗菌药物，产碳青霉烯酶是CRE最常见的耐药机制。碳青霉烯酶包括A类、B类和D类酶：①A类酶为丝氨酸酶，多数由质粒介导，可被阿维巴坦抑制、部分被克拉维酸抑制，产酶菌株通常仅对替加环素、多黏菌素、头孢他啶/阿维巴坦敏感[22]。A类酶中，产KPC酶为肠杆菌目细菌、尤其是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药的最主要机制，其中KPC～2型为我国肠杆菌目中的流行类型，在产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌中占比超过70%[24]。② B类酶为金属酶，多数由染色体介导，可水解青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类，但对氨曲南水解活性弱；不能被β～内酰胺酶抑制剂（如阿维巴坦）抑制，可被EDTA抑制；产酶株通常仅对替加环素、多黏菌素敏感，少数对氨曲南敏感[22]。B类酶包括NDM、IMP、VIM、GIM、SPM酶等，其中NDM酶为我国大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌（患儿分离株）中的流行类型，以NDM～1型、NDM～5型最为常见[29]。③D类酶为OXA酶，同样为丝氨酸酶，多由质粒介导，对苯唑西林水解活性强，其活性难以被大部分酶抑制剂抑制，但可被阿维巴坦抑制[22]。我国D类酶在儿童患者分离肺炎克雷伯菌中占比更为突出，常见亚型包括OXA～48型、OXA～23型等。在产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌中，OXA～48样碳青霉烯酶检出率为 13.3%[29]。

CRE的表型检测方法包括Carba NP试验、改良碳青霉烯失活试验（mCIM、eCIM）、碳青霉烯酶抑制剂增强试验等，基因型检测方法包括酶免疫层析技术、GeneXpert检测技术、FlimArray技术等[2～4]。

部分肠杆菌目细菌表现为对亚胺培南的天然高水平耐药，如变形杆菌属、摩根菌属、普罗威登斯菌属，临床需进一步检测美罗培南、多利培南和厄他培南的MIC以判断该菌株是否为CRE菌株。阴沟肠杆菌复合体中可见厄他培南单耐药菌株，但多数不是由产碳青霉烯酶引起[30]。

产不同碳青霉烯酶菌株所致感染的治疗方案不同。产丝氨酸酶（A类、D类酶）菌株通常对替加环素、多黏菌素、头孢他啶/阿维巴坦敏感；产金属酶（B类酶）菌株通常仅对替加环素、多黏菌素敏感，少数对氨曲南敏感，而均对头孢他啶/阿维巴坦耐药[22，29]。

2.4 多重耐药铜绿假单胞菌

铜绿假单胞菌的药物外排系统对其天然耐药和多重耐药的发生至关重要。铜绿假单胞菌至少存在10种外排系统，基本上属于RND家族，主要包括 Mex AB～OprM、Mex CD～OprJ、Mex EF～OprN和Mex XY～OprM[31]。细菌外膜上存在多种孔蛋白，为亲水性抗菌药物通道。铜绿假单胞菌外膜上的特异性通道蛋白有OprC～H。其中OprC、OprD、OprE 的相对分子质量较小，可以让一部分相对分子质量较小的亲水性碳青霉烯类抗菌药物通过，如OprD2为亚胺培南的特异性通道，其丢失可导致菌株对亚胺培南耐药、对头孢他啶仍敏感[31]。编码孔蛋白的基因发生突变可下调孔蛋白表达，是铜绿假单胞菌对碳青霉烯类、氨基糖苷类、黏菌素和氟喹诺酮类耐药的机制之一[31]。

铜绿假单胞菌可产生多种β～内酰胺酶，包括ESBLs、AmpC酶、碳青霉烯酶、青霉素酶等，以染色体介导的酶最为多见。铜绿假单胞菌所产的AmpC酶为诱导型酶，头孢西丁、亚胺培南等β～内酰胺酶类、β～内酰胺酶抑制剂（克拉维酸）均可诱导AmpC酶产生，因此不推荐采用含克拉维酸制剂治疗产AmpC 酶铜绿假单胞菌所致感染[32]；铜绿假单胞菌所产的碳青霉烯酶以金属酶IMP、VIM为主，但有研究发现携带NDM～1型酶的超级细菌对目前所有β～内酰胺类均耐药、对多黏菌素耐药[31，33]。

2.5 多重耐药鲍曼不动杆菌

与铜绿假单胞菌类似，鲍曼不动杆菌可通过改变外膜通透性及外排系统活性介导对氟喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类及多黏菌素类耐药。OmpA蛋白为鲍曼不动杆菌的主要非特异性通道，其中的碳青霉烯类耐药相关外膜蛋白（CarO）突变与美罗培南、亚胺培南耐药相关[34]。

鲍曼不动杆菌可产生多种β～内酰胺酶，包括ESBLs、碳青霉烯酶和AmpC酶等。鲍曼不动杆菌所产ESBLs以TEM型为主，碳青霉烯酶则以OXA酶、金属酶为主，常见酶型包括OXA～23、OXA～24、OXA～40、OXA～48、OXA～58 和OXA～51型等，我国主要流行酶型为 OXA～23[22，34～36]。

2.6 氨苄西林耐药流感嗜血杆菌

通过产β～内酰胺酶而对氨苄西林、阿莫西林耐药的株被称为β～内酰胺酶阳性氨苄西林耐药（β～lactamase～positive ampicillin～resistant，BLPAR）流感嗜血杆菌，目前已知的β～内酰胺酶基因型包括TEM和ROB型，以TEM～1型为主[37～38]。部分氨苄西林耐药菌株β～内酰胺酶检测阴性（β～lactamase～negative ampicillin resistant，BLNAR），2014年我国BLNAR菌株检出率为8.6%[39]，且呈现升高趋势。 BLNAR菌株的主要机制为ftsI基因点突变导致PBP3蛋白的空间构象改变，对β～内酰胺类亲和力降低，导致菌株对第一、二代头孢菌素及氨基青霉素/β～内酰胺酶抑制剂复合制剂类抗菌药物（如阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦）耐药[37]。部分产酶株可合并ftsI基因突变，表现为对阿莫西林/克拉维酸耐药，被称为β～内酰胺酶阳性阿莫西林/克拉维酸耐药株（β～lactamase～positive amoxicillin/clavulanate～resistant，BLPACR）。临床可采用头孢硝噻吩纸片法检测β～内酰胺酶：若检测结果为β～内酰胺酶阳性，提示菌株对阿莫西林、氨苄西林和哌拉西林耐药；若检测结果为β～内酰胺酶阴性且对氨苄西林耐药，提示菌株对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢克洛、头孢呋辛酯耐药；若检测结果为β～内酰胺酶阳性且阿莫西林/克拉维酸耐药，提示菌株对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、头孢克洛、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢呋辛、头孢呋辛酯耐药[2～4]。

2.7 淋病奈瑟菌耐药性分析

淋病奈瑟菌对青霉素耐药的主要机制为产生β～内酰胺酶，产酶株对青霉素、氨苄西林和阿莫西林耐药[40～41]，临床可采用头孢硝噻吩纸片法检测β～内酰胺酶；淋病奈瑟菌对头孢菌素类耐药的主要机制为penA基因突变导致PBP2蛋白改变，与头孢菌素类亲和力降低，导致菌株对头孢曲松、头孢克肟等抗菌药物耐药[40，42]。淋病奈瑟菌对阿奇霉素耐药的主要原因是药物作用靶位的改变（如23S rRNA突变），且药物外排增加也是其耐药机制之一[40]。

2.8 卡他莫拉菌耐药性分析

90%以上的卡他莫拉菌产β～内酰胺酶，以BRO型为主，其中BRO～1型约占90%。产酶株对青霉素、氨苄西林及阿莫西林耐药，β～内酰胺酶抑制剂可抑制其活性[43]。临床可采用头孢硝噻吩纸片法检测β～内酰胺酶。卡他莫拉菌通常对阿莫西林/克拉维酸、第二及三代头孢菌素、大环内酯类、四环素类、利福平、氟喹诺酮类和磺胺类等药物敏感。