肿瘤微环境中TGF-β调控PD-L1表达机制的研究进展

周康杰 胡 楠 张竞舟 洪义东 卞保祥 宋子琰 吴风雷

肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)即肿瘤细胞产生和生活的内环境，包括肿瘤细胞及其周围的成纤维细胞、免疫细胞、炎性细胞、胶质细胞、细胞间质、微血管等，其具备缺氧、慢性炎症及免疫抑制的3项特征，形成十分复杂的机制网络,对肿瘤的发展产生重要作用[1]。微环境中的局部信号分子如IL-4、IL-6、IL-10、前列腺素E2(PGE2)、巨噬细胞集落刺激因子和TGF-β, 参与慢性炎症及Th2细胞的形成,促进肿瘤的发生、发展；另TGF-β通过多个过程促进肿瘤进展，包括维持肿瘤干细胞稳态、抑制免疫反应、诱导EMT和转移等[2]。此外，TGF-β还同时具有肿瘤抑制因子和肿瘤启动子的活性，并且能够调节癌基因和抑癌基因的表达[3]。

免疫检查点是维持自身耐受性和调节免疫反应信号通路的关键因子[包括程序性死亡受体1(programmed death-1，PD-1)/程序性死亡受体配体1、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)等免疫检查点]，主要通过影响T淋巴细胞免疫应答发挥作用。生理情况下，免疫检查点能够保护正常组织免受自身免疫和炎症的伤害。而在肿瘤状态下，T淋巴细胞的激活受到抑制，免疫检查点无法正常发挥功能，从而引发肿瘤的免疫逃逸。ICB治疗是通过有效阻断PD-L1/PD-1、CTLA-4等免疫检查点，间接强化抗肿瘤免疫反应，提高免疫治疗效果，其中针对免疫检查点PD-1/PD-L1已成为继手术、化疗、放疗、靶向药物等常见治疗手段之外最新的肿瘤治疗方法之一。2021年中国临床肿瘤学会 (Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO)发布的胃癌指南中，免疫治疗首次进入中国胃癌的一线用药推荐。

尽管目前ICB治疗在胃癌治疗领域中前景良好，但仍存在免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors, ICIs)阻断效果与疗效不匹配等局限性。有研究表明，在肿瘤免疫微环境中，以肿瘤为中心，将其分为3种表型，分别为免疫沙漠表型、免疫炎症表型及免疫豁免表型[4]。免疫沙漠表型：肿瘤实质和基质内都没有有效的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)；免疫炎症表型：肿瘤细胞实质、基质、周围环境均有大量的CTLs浸润；免疫豁免表型：TME有大量CTLs细胞存在，但不能渗透到肿瘤实质内，而是被限制在肿瘤细胞的外围基质。此表型经ICIs治疗后，外围基质 CTLs 细胞有增殖和活化，但未浸润至肿瘤实质，抗肿瘤效果差。这也可能是某些肿瘤突变负荷高，免疫原性好，但治疗效果却不尽如人意的原因[4]。

有研究表明，高表达TGF-β的恶性肿瘤多为免疫豁免表型，当阻断TGF-β信号通路后，CTLs 细胞在肿瘤实质内的浸润明显增多，TME转化为免疫炎症表型，明显增强了免疫检查点抑制剂 PD-L1 单抗(阿特珠单抗)的抗肿瘤疗效[5]。还有研究报道，在晚期消化系统恶性肿瘤中，TGF-β的表达与肿瘤实质中CTLs细胞浸润呈负相关[6]。此外，有研究发现，阻断 TGF-β信号通路可以削减TME中CTLs细胞向免疫抑制性T细胞的转化[7]。研究发现，在TME的肿瘤细胞、免疫细胞及成纤维细胞中TGF-β与PD-L1表达都具有正相关性[8～12]。这些通路机制的研究为胃癌的免疫治疗提供新的靶点，有助于提高ICB治疗的疗效。

一、TGF-β在TME中的作用

转化生长因子超家族由60多个不同的成员组成，包括TGF-β、激活素、抑制素、骨形态形成蛋白、生长分化因子等，并且已被确认在各种细胞环境中促进TGF-β信号表达。在哺乳动物中TGF-β信号有3种高度相似的异构体，分别是TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，这些异构体共享约80%的相同氨基酸序列。TGF-β信号通路具有多种生物学功能，如调节细胞生长、分化、凋亡、运动、侵袭、细胞外基质生成、血管生成和免疫应答等。TGF-β在肿瘤的发生、发展过程中有两种不同的作用，即TGF-β具有肿瘤抑制因子或肿瘤启动子活性，从而调节癌基因和抑癌基因的表达[3]。

在早期肿瘤中，TGF-β通过促进细胞周期阻滞和凋亡发挥抗肿瘤作用，而在晚期肿瘤中TGF-β则通过促进免疫抑制、促进肿瘤血管生成、诱导上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)等机制调控肿瘤的转移和复发[13]。肿瘤过度产生的TGF-β创造了一种免疫抑制环境，这种环境对于在肿瘤进展期促进肿瘤细胞的生存和生长至关重要[14]。

TGF-β能够刺激成纤维细胞转化为肿瘤相关成纤维细胞，促进肿瘤细胞的免疫逃逸，并且肿瘤相关成纤维细胞可以分泌多种因子促进肿瘤生长和转移，如成纤维细胞生长因子、基质细胞衍生因子1，基质金属蛋白酶和胰岛素样生长因子1等[15]。TGF-β信号通路和肿瘤血管形成密切相关，TGF-β/血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)相关信号通路是肿瘤血管形成的重要通路。同时TGF-β能够显著增加VEGF/VEGF-R的表达，促进内皮细胞的毛细血管形成和迁移，从而导致肿瘤细胞的血管生成，从而促进肿瘤侵袭和转移。TGF-β可通过下调E-钙黏蛋白、上调波形蛋白和N-钙黏蛋白的表达，诱导肿瘤细胞发生EMT，进一步促进肿瘤细胞的转移[16]。TGF-β通过抑制抗原递呈细胞[如树突状细胞(dendritic cells, DCs)]的迁移和诱导凋亡来逃避免疫监视。肿瘤来源的TGF-β可显著抑制DCs激活的CD4+T细胞的增殖。TME中的TGF-β使肿瘤相关巨噬细胞从肿瘤前(M2)表型极化到抗肿瘤(M1)表型。

目前在未治疗的肿瘤样本组织病理切片中，有研究将同PD-L1/PD-1治疗响应相关的免疫表型分为3种类型，如免疫炎症表型、免疫沙漠表型及免疫豁免表型[4]。免疫炎症表型：肿瘤实质中存在有大量CD4+和CD8+的淋巴细胞，也伴随有髓系细胞和单核细胞。在肿瘤浸润淋巴细胞及肿瘤细胞中可能表达 PD-L1。这一表型反映出在TME中被抑制的抗肿瘤活性。对PD-L1/PD-1通路的阻断治疗最有可能在这一表型中有效。免疫豁免表型：免疫细胞未能浸润入肿瘤实质，而被限制在基质及肿瘤周边为特征。这一表型通常对 PD-L1/PD-1抑制剂无效。免疫沙漠表型：T淋巴细胞在肿瘤实质以及周边基质的缺失为特征。这一表型大多对 PD-L1/PD-1抑制剂无效。而高表达TGF-β的肿瘤多为免疫豁免表型，阻断TGF-β信号通路后可将免疫豁免表型转化为免疫炎症表型，促进肿瘤中CTLs细胞的浸润，从而抑制肿瘤进展[5]。

二、TGF-β与TME中免疫检查点PD-L1的关系

1.TGF-β调控DCs中PD-L1的表达:TGF-β能上调抗原递呈细胞(antigen-presenting cells，APC)上PD-L1的表达,而APC表面表达的PD-L1又释放抑制性可溶性分子到TME中,通过PD-L1与其受体的相互作用直接抑制CTLs,或者诱导CTLs释放抑制性可溶性分子[11]。即TGF-β上调DCs的PD-L1表达，导致T淋巴细胞失能、降低抗肿瘤反应从而产生免疫抑制反应。

PD-L1是DC上表达的关键共抑制分子能够参与免疫耐受的诱导和维持。DC上表达的PD-L1和T淋巴细胞上表达的PD-1相互作用可以抑制T淋巴细胞的免疫活性[17]。PD-L1的表达与调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)的发育和功能有关[18]，与T淋巴细胞共培养TGF-β-DC 48h，结果显示TGF-β-DC明显诱导T淋巴细胞凋亡和CD4+CD25+Foxp3+Treg的产生。进行相关分析表明，TGF-β-DC可以诱导T淋巴细胞凋亡和DC中PD-L1的表达。TGF-β可增加DCs中PD-L1及转录激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)的表达，并表现出时间和剂量依赖性，而阻断STAT3后PD-L1的表达明显下降。与TGF-β共培养的DC可诱导T淋巴细胞凋亡，增加CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分率。即TGF-β可以通过STAT3信号上调DC中PD-L1的表达，进而抑制T淋巴细胞免疫，抗肿瘤作用减弱。

2.TGF-β调控肿瘤细胞中PD-L1的表达：在乳腺癌细胞外泌体中，PD-L1与TGF-β表达呈显著的正相关。在体外，TGF-β诱导外泌体中PD-L1的表达，而阻断TGF-β后外泌体中PD-L1的水平下降。外泌体中PD-L1通过诱导CD8+T细胞的功能障碍增强了免疫抑制作用。单一阻断TGF-β可减少肿瘤细胞中外泌体中PD-L1释放，而同时阻断TGF-β和外泌体中PD-L1可增强肿瘤特异性T细胞的靶向杀伤作用[10]。有研究表明，在肺癌细胞中，TGF-β能够显著上调PD-L1的表达[9]。同时在研究乐伐替尼与瑞格菲尼对肝癌细胞PD-L1的作用及机制中发现，通过转染siRNA干扰肝癌Hep3B和SMMC7721 细胞中TGF-β1的表达，发现干扰组的PD-L1蛋白表达量较对照组下降，即抑制TGF-β1的表达可以下调PD-L1的表达。TGF-β1与PD-L1之间存在相关机制和功能联系[8]。另有研究在肿瘤患者血液样品中发现，肿瘤患者基线可溶性TGF-β与可溶性PD-L1呈显著正相关；治疗后可溶性TGF-β的变化与治疗后可溶性PD-L1值的变化与基线值比较也存在显著正相关[19]；这些研究发现证明了TGF-β与PD-L1的表达呈显著的正相关性，即TGF-β与PD-L1之间确实存在相关机制通路。

而在顺铂耐药的肺癌细胞中，脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FASN)-TGF-β通路能够调节PD-L1的表达，阻断TGF-β信号通路，可抑制PD-L1的表达。TGF-β抑制剂与PD-L1抗体联合治疗能够进一步增强NK细胞对顺铂耐药细胞的杀伤作用[20]。在肿瘤细胞中，EMT/β-catenin/多元醇二磷酸寡糖蛋白转移酶(dolichyl-diphosphooligosaccharideprotein glycosyltransferase subunit，STT3)/PD-L1通路可以调节PD-L1的表达，TGF-β可诱导转录因子β-catenin 表达，调节EMT/β-catenin/STT3/PD-L1通路，从而促进PD-L1糖基化增强[21]。另在研究PD-L1在胃癌EMT信号转导过程受NF-κB的调控中发现，在体外胃癌细胞中，使用TGF-β1受体抑制剂，能够降低了PD-L1的表达[22]。在进一步研究中发现，非肿瘤细胞(成纤维细胞)可以通过具体的机制通路调控PD-L1的表达，即TGF-β可以通过Smad2/3或non-Smad2/3(PI3K-AKT-MTOR)信号通路上调TME中PD-L1表达[12]。这些结论表明，在肿瘤细胞中TGF-β能够通过相关机制通路调控PD-L1的表达。

三、阻断TME中TGF-β在ICB治疗中的作用

传统免疫治疗主要通过强化抗肿瘤免疫反应进行治疗，但由于免疫检查点的存在，难以造成持久有效的抗肿瘤免疫作用。而ICB治疗则通过有效阻断PD-L1/PD-1、CTLA-4等免疫检查点，间接强化抗肿瘤免疫反应，提高免疫治疗效果。但是ICIs在未经选择的实体瘤患者中，有效率只有10%～30%[23]。其中一个可能的原因是ICIs只攻击由肿瘤及其TME组成的复杂系统的一个方面。除了PD-1/PD-L1轴和CTLA-4配体相互作用外,TME中还有许多其他的免疫抑制实体，如Tregs、骨髓衍生抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)和细胞因子(IL-8和TGF-β)等,这可能导致次优的抗肿瘤免疫反应[24]。肿瘤中TGF-β的过度分泌与肿瘤免疫因子增加、TIL杀伤肿瘤作用减弱、免疫效应细胞浸润受限密切相关[25]。TGF-β可能是肿瘤治疗中的一个靶点，TGF-β/免疫检查点的双重阻断具有协同作用。在TME中，肿瘤细胞往往通过多种免疫抑制途径逃避免疫监视。TGF-β能够改变抗肿瘤免疫反应的多个过程，包括抗原递呈、T淋巴细胞浸润和肿瘤杀伤活性。因此，ICI单药治疗可能无法恢复强大的抗肿瘤免疫应答。

研究表明，在小鼠体内建立人类微卫星稳定型结直肠癌模型，发现ICI单药治疗不能有效清除肿瘤细胞。然而，联合TGF-β阻断治疗明显增强了ICI的抗癌作用。进一步研究发现，TGF-β可以通过促进免疫豁免表型的形成而诱导免疫抑制，而这些免疫豁免表型容易对ICI治疗产生抗药性[6]。这在转移性尿路上皮癌患者中也有类似的现象。对于接受阿替利珠单抗治疗的转移性尿路上皮癌患者(特别是在肿瘤周围基质中富集大量CD8+T细胞的患者)，治疗效果与TGF-β的表达高度相关[25]。研究人员用EMT6小鼠乳腺和MC38小鼠结肠癌模型重建了免疫豁免表型，单一阿替利珠单抗和TGF-β阻断剂均不能减轻肿瘤负荷，但阿替利珠单抗和TGF-β阻断剂联合治疗均能有效地根除肿瘤细胞。进一步的研究表明，双阻断的协同作用与增强T淋巴细胞浸润到肿瘤中心和抗肿瘤免疫应答有关[25]。阻断TGF-β可增强抗PD-1抗体对小鼠模型的治疗作用[26]。同样，通过诱导肿瘤CD8+T细胞中PD-1的上调，发现MDSCs分泌的TGF-β与PD-1/PD-L1抑制剂耐药高度相关[27]。在顺铂耐药的肺癌细胞中，TGF-β抑制剂与PD-L1抗体联合治疗能够进一步增强NK细胞对顺铂耐药的肺癌细胞的杀伤作用[20]。双PD-1/PD-L1和TGF-β信号通路阻断在体外/体内中协同恢复了抗原特异性CD8+T细胞的功能和抗肿瘤能力。

那么就有可能将PD-L1/PD-1抑制剂和TGF-β抑制剂结合，提高抗肿瘤免疫治疗的活性。例如，M7824能够有效地、具体地同时绑定 PD-L1和TGF-β。在合成小鼠模型中，M7824比单独使用抗PD-L1抗体或抗TGF-β治疗更有效地抑制肿瘤生长和转移TGF-β受体抑制剂可以增强抗PD-L1单克隆抗体的抗肿瘤作用。联合抑制TGF-β和PD-L1治疗组的存活率明显高于抗PD-L1单克隆抗体组。阻断TGF-β受体活性增强了抗PD-L1单克隆抗体治疗的抗肿瘤免疫能力，提高了免疫原性和MC38肿瘤模型的整体长期生存，M7824提高了肿瘤浸润性淋巴细胞的数量和免疫能力[28]。同样的，靶向CTLA-4和TGFβR-Ⅱ的双功能融合蛋白可抑制Tregs和Th17细胞的分化，并增加肿瘤特异性IFN-γ+效应细胞和记忆细胞的功能。抗CTLA-4-TGFβR-Ⅱ融合蛋白的抗癌作用优于CTLA-4或PD-1抑制剂[7]。

四、展 望

在TME中，TGF-β通过促进纤维化、促进肿瘤血管生成、促进肿瘤细胞远处转移、诱导EMT、诱导免疫抑制以及与免疫表型之间的关系等机制促进肿瘤进展。TGF-β在肿瘤发生、发展中的重要作用，使其成为早期诊断肿瘤、预测肿瘤进展的标志物。由于TGF-β通过多种机制调控肿瘤的转移和复发，TGF-β信号已被证明与靶向和常规肿瘤药物以及免疫治疗的耐药性有关，所以其成为抑制肿瘤进展的重要靶点，可以通过多种方式阻断TGF-β信号通路，从而抑制肿瘤进展。TGF-β改变了抗肿瘤免疫反应的多个过程，包括抗原递呈、T淋巴细胞浸润和肿瘤杀伤活性。

2020年ESMO上公布的Checkmate-649研究结果表明，在纳武利尤单抗联合化疗组中，晚期胃癌患者中PD-L1综合阳性评分(combined positive score, CPS)≥5和CPS≥1的患者总生存期(overall survival，OS)都达主要研究终点，CPS≥5比CPS≥1的患者OS获益更明显，临床数据更具有优势[29]。因此，PD-L1的高表达可能是影响ICB治疗重要的因素。尽管目前ICB治疗在胃癌治疗领域中前景良好，但仍存在ICIs效果与疗效不匹配等局限性，即PD-1抑制剂阻断效果与疗效不匹配，这是由于PD-1抑制剂虽然有效地阻断了配体激活的信号转导，但它无法抑制T淋巴细胞内PD-L1自身持续的信号转导。只要PD-L1蛋白存在时，即对T淋巴细胞产生抑制作用[30]。在肿瘤中，既要阻断胞外PD-1和PD-L1结合，又要阻断胞内PD-L1的信号转导，从而恢复T淋巴细胞正常功能活性，持续发挥抗肿瘤活性。能否找到相关通路阻断胞内PD-L1的信号转导，成为提高免疫治疗疗效的关键。

高表达TGF-β的恶性肿瘤多为免疫豁免表型，阻断TGF-β信号通路后，CTLs 细胞在肿瘤实质内的浸润明显增多，TME转化为免疫炎症表型，明显增强了ICIs(PD-L1)的疗效。表明在TME 中TGF-β抑制了 CTLs 细胞向Tregs细胞的转化以及CTLs向肿瘤实质的浸润[5]。同时在DCs、肿瘤细胞和成纤维细胞等研究中，已经证明了TGF-β与PD-L1的调节关系。因此找到TME中TGF-β调控PD-L1表达的相关机制通路，并阻断其通路表达，可以提高ICB治疗的疗效。TGF-β信号的高表达与PD-1/PD-L1信号轴的升高破坏了抗肿瘤免疫反应。靶向TGF-β将为提高传统癌症治疗的疗效提供一个新的方法，并且首选靶向TGF-β与免疫治疗相结合来增强患者的反应。因此，如果在TME中找到TGF-β调节PD-L1变化的具体机制通路，那么选择更佳的治疗方案，如联合转化TME免疫表型的抗TGF-β药物，提高肿瘤患者的免疫治疗效果，为肿瘤免疫治疗带来新的方向。