m6A甲基化修饰与泌尿系统肿瘤关系的研究进展

计 锐， 郑君芳

(1.首都医科大学附属同仁医院本专科教育处，北京市100176；2.首都医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系 肿瘤侵袭转移研究实验室，北京市100069)

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladeno-sine,m6A)修饰是位于腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰，往往含有一段保守基序RRACH(R代表A或G，H代表A、C或U)，它是真核生物RNA最常见的一种表观修饰方式，存在于各种不同类型的RNA上，包括信使RNA(mRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(Micro RNA，miRNA)、环状RNA(circular RNA，circRNA)等[1]。m6A修饰是一种由多种蛋白维持的动态、可逆平衡过程，包括甲基转移酶，去甲基化酶以及阅读蛋白等。m6A甲基化修饰参与调控mRNA的剪切加工、核转运、降解及翻译等过程，在mRNA的整个生命周期中发挥着关键作用。近年来，m6A甲基化修饰与肿瘤发生发展的关系逐渐受到重视，但m6A甲基化修饰与泌尿系统肿瘤中的研究并不多见。本文就m6A甲基化修饰的生理作用机制及其与泌尿系统肿瘤之间的关系做一综述。

1 m6A甲基化修饰的3种蛋白

1.1 m6A甲基转移酶

m6A甲基转移酶利用S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基介导RNA发生甲基化修饰，主要包括甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase-like 3，METTL3)、甲基转移酶样蛋白14(methyltransferase-like14，METTL14)及其辅助因子肾母细胞瘤1-相关蛋白(Wilm’s tumor 1-associated protein,WTAP)等组成的甲基转移酶复合物，此外，还包括METTL3的同源物甲基转移酶样蛋白16(methyltransferase-like 16，METTL16)、病毒分离剂类m6A甲基转移酶相关蛋白(virus isolator m6A methyltransferase-associated proteins，VIRMA，也称KIAA14929)、RNA结合基序蛋白15/15B(RNA-binding motif protein 15/15B，RBM15/15B)和含锌指CCCH结构域的蛋白质13(protein containing zinc finger CCCH domain 13，ZC3H13)等其他蛋白质[2]。Wang等[3]发现，METTL3是一种催化活性甲基转移酶，METTL14在其活性位点提供结构支持以实现催化作用。RNA GAC和AAC甲基化由METTL3选择性诱导，而METTL14选择性诱导RNA GAC甲基化，二者协同介导m6A甲基化过程。METTL3和METTL14形成异二聚体，WTAP通过募集METTL3和METTL14来促进m6A甲基化进程[4]。VIRMA往往优先选中3′-UTR附近的mRNA来介导甲基化，ZC3H13与WTAP等其他辅助因子共同作用控制m6A甲基化过程[5]。

1.2 m6A去甲基化酶

m6A去甲基化酶的作用是对已经发生m6A修饰的碱基去除甲基化修饰，肥胖相关(fat mass and obesity associated,FTO)基因和α-酮戊二酸依赖的加双氧酶ALKB同源蛋白5(α-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homolog 5,ALKBH5)均属此类。FTO和ALKBH5以Fe(II)和α-酮戊二酸依赖性的方式催化m6A的去甲基化，他们均为α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族成员[6]。m6A的去甲基化依赖FTO的氧化功能，生理条件下，m6A是FTO的最佳底物。m6A修饰在m6A去甲基化酶与m6A甲基转移酶共同作用下，成为一个动态、可逆且相对平衡的过程。

1.3 m6A阅读蛋白

m6A阅读蛋白主要作用是识别发生m6A修饰的碱基，进而指导下游生物活动。阅读蛋白主要包括YT521-B同源性(YTH)域家族成员、YTHDF1～3和YTHDC1～3，它们均可以选择性嵌入共有序列m6A核苷酸的保守m6A结合域，这有助于募集参与控制mRNA的各种效应因子。YTHDC1通过与pre-mRNA结合并影响剪接位点的选择而有助于选择性剪接[7]。YTHDC2对不同mRNA翻译和稳定性存在着不同影响，稳定生殖细胞减数分裂特异的转录本，同时加速有丝分裂的mRNA靶标的降解[8]。研究发现，YTHDF2减少了多种m6A转录本的半衰期，而YTHDF3与YTHDF1可以协同加速甲基化RNA的翻译过程，也可以与YTHDF2相互作用促进mRNA的降解[9]。异质核糖核蛋白(heteroribonucleoprotein，HNRNP)家族的某些成员也可作为阅读蛋白，如HNRNPA2B1为特定的m6A结合蛋白，通过与m6A甲基化的转录本相结合来对主要的miRNA加工和成熟进行促进。HNRNPC和HNRNPG可调节mRNA的丰度和剪接。研究发现，胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein，IGF2BP，包括IGF2BP1/2/3)可以识别m6A修饰，它以m6A依赖性方式增加靶mRNA的稳定性并促进其储存，进而影响基因转录水平和癌症的发生发展，与YTHDF2的作用刚好相反[10]。

2 m6A修饰与泌尿系统肿瘤关系

m6A修饰不会改变碱基编码，但它通过阅读蛋白与下游RNA的相互作用，在多水平上影响基因表达，参与了人类各种疾病的发生发展过程，尤其在癌症中，扮演着十分重要的角色。研究表明，m6A修饰在多种癌症中水平失调，影响肿瘤干细胞自我更新与分化等过程，不仅调控多种肿瘤的发生、发展和转移，也会引起其复发以及耐药[11]。在胶质母细胞瘤(glioblastoma，GM)中，ADAM19上m6A甲基化修饰降低会增强癌基因的表达，促进神经胶质瘤干细胞的生长和自我更新，导致肿瘤发生[12]；而同在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中m6A修饰的增强却可以促进成熟mRNA的降解，进而加速肿瘤的发生；在乳腺癌(breast cancer)中，m6A甲基化上调也会加速肿瘤的发生[10]。由此可见，m6A修饰酶表达水平能改变肿瘤相关基因mRNA的甲基化水平，进而实现对下游致癌基因或抑癌基因表达的调控，甚至在同一种肿瘤的进展过程中，m6A修饰的表达能发挥相反的作用。

2.1 m6A修饰与肾癌

在泌尿系肿瘤中，肾癌是较为常见的一类，其中临床最常见的类型是肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)，由于其早期症状不明显，大多数患者均在病情晚期被发现，预后多不良，转移和复发的风险很高，病死率较高。

RCC细胞系总m6A修饰水平和正常肾小管上皮细胞系相比差异有显著性，通过分析19个m6A调节因子之间的关联确认了m6A甲基转移酶的主要作用[13]。WTAP与METTL3和METTL14的表达水平相关，它们共同影响m6A修饰水平。WTAP是唯一与其他5种m6A甲基转移酶存在已知交互关系的转移酶，WTAP在ccRCC中显著上调，它的高表达也与ccRCC患者总生存期(overall survival,OS)相关。Li等[14]发现，肾癌中METTL3 mRNA和蛋白质表达均较低。低表达的METTL3通过以下3种途径促进癌症的发生发展：①敲低METTL3可以通过调节p-PI3k，p-Akt，p-mTOR通路增加p-PI3k，p-Akt，p-mTOR和p-p70的表达，并减少p-4EBP1的表达，进而促进细胞增殖；②下调的METTL3通过反向调节上皮间质转化(EMT)途径中波形蛋白，β-catenin和N-cadherin以及同向调节E-cadherin，对细胞的迁移和侵袭过程起到积极促进作用；③METTL3的下调还可以显著增加G1期的细胞周期停滞，降低抑癌基因P21的表达。

此外，ALKBH5高表达与肿瘤体积、TNM分期以及预后不良程度呈正相关[15]。ALKBH5的稳定表达在体外促进肾癌细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭，其主要机制为ALKBH5通过m6A依赖方式调节AURKB mRNA的稳定性进而影响潜在靶标AURKB的表达，对细胞增殖进行调控。敲低的ALKBH5导致RCC细胞中AURKB mRNA的3′-UTR m6A水平显著增加。Zheng等[13]发现，ccRCC组织中m6A结合蛋白IGF2BP1、IGF2BP2、IGFBP3、HNRNPA2B1表达上调。

2.2 m6A修饰与前列腺癌

男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤是前列腺癌(prostate cancer，PC)。近年来PC的治疗发展迅速，在内分泌去势治疗、内分泌治疗联合化疗以及生物分子靶向治疗等方面均有所突破，但这些治疗只能短期延缓疾病进程，无法做到根治。

Cai等[16]通过TCGA数据库和Western印迹分析实验发现METTL3在前列腺癌细胞系中过表达。METTL3通过m6A修饰的方式调节GLI、PAPR cleavage、Caspase 3/7、BclG2和Bcl-xL(抗凋亡)蛋白的活性以及SHH(Sonic Hedgehog)信号通路下游基因mRNA的表达水平，进而改变PC细胞的增殖、存活、集落形成和迁移能力。YTHDF3基因水平缺失，FTO和ALKBH5扩增是前列腺癌复发的危险因素。在Ji等[17]收集的病例中发现约70.2% m6A甲基化调节基因的基因拷贝数变异事件(copy number variations，CNV)是DNA拷贝数丢失，在所有m6A甲基化调节剂CNV中，ZC3H13拷贝数丢失百分比最高(46.1%)，其次是FTO和YTHDC2。在所有的m6A调控基因中，YTHDF3、IGF2BP3和HNRNPA2B1拷贝数增加最常见。通过研究CNV基因水平的改变和m6A甲基化调节剂的突变与前列腺癌临床特征之间的关系，可以明确m6A调节剂改变的频率与较高的TNM分期和生化复发密切相关。

Wang等[18]发现，PSA和基于METTL14和YTHDF2计算的风险评分与PC的OS显著相关，高危评分患者发生PC的HR高于PSA值高的患者，提示METTL14和YTHDF2可以作为PC有效生存预测的生物标志物，具有作为治疗靶点的潜力。

2.3 m6A修饰与膀胱癌

膀胱癌(bladder cancer，BCa)是最常见的泌尿道恶性肿瘤，在男性发病率中排第4位，死亡率第8位，初诊时70%以上患者可确诊为非肌层浸润性膀胱癌(non muscular invasive bladder cancer，NMIBC)[19]。主要治疗方法包括膀胱内灌注化疗、免疫治疗以及对患者肉眼可见的肿瘤组织进行切除的联合应用，经尿道膀胱肿瘤激光整块切除术和电动力药等[19]。

METTL3在体内或体外的下调均可以抑制膀胱癌的增殖和转移。Xie等[20]发现，由甲基转移酶METTL3和识别蛋白YTHDF2组成的m6A调控轴与膀胱癌发生发展密切相关。METTL3/YTHDF2 m6A轴可以通过降解肿瘤抑制因子SETD7和KLF4的mRNA，促进BCa的进程。因此，METTL3/YTHDF2轴可能是治疗BCa的潜在靶标。METTL14在膀胱癌和膀胱肿瘤起始细胞(TICs)中也存在低表达。Gu等[21]发现，Notch1是METTL14 m6A修饰的功能靶基因，METTL14的敲除大大增加了Notch1的表达，进而促进膀胱TICs的增殖、自我更新、转移和肿瘤起始能力。因此，可以通过调节METTL14/m6A/ Notch1途径对膀胱癌进行干预及治疗。

Jin等[22]发现，m6A甲基转移酶METTL3和去甲基化酶ALKBH5通过调节膀胱癌细胞中ITGA6的表达来改变细胞黏附功能。在大多数膀胱癌样本中，ITGA6和METTL3表达中等或较高，而ALKBH5表达较低。在人组织微阵列中ITGA6的上调与人BCa组织中METTL3的表达增加和ALKBH5表达降低相关，且ITGA6高表达的患者存活率较低，膀胱癌患者肿瘤样品ITGA6表达水平与组织学等级和分期呈正相关。因此，m6A修饰的ITGA6可确定为治疗BCa的潜在治疗靶标。

2.4 m6A修饰与睾丸生殖细胞肿瘤

睾丸生殖细胞肿瘤(testicular germ cell tumors，TGCT)是15～44岁男性中最常见的恶性肿瘤。目前临床中TGCT的治疗主要依赖于主动监测，辅助单剂量卡铂化疗、顺铂化疗、放疗和腹膜后淋巴结清扫术。早期TGCT经治疗后长期存活率接近100%[23]，因此，找到早期诊断TGCT的靶标对患者的治疗和预后有着极大的意义。Nettersheim等[24]发现，在GCT组织和细胞系中，成纤维细胞和不同发育阶段的生殖细胞的RNA中可检测到与METTL3、ALKBH5、YTHDC1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2和HNRNPC相关的m6A甲基化修饰，且分化后的GCT细胞的RNA中m6A修饰水平增加，提示m6A修饰与GTCs的进展有密切关联。Lobo等[25]发现，在TGCT的不同类型精原细胞瘤(Seminomas，SEs)和非精原细胞瘤(Non-Seminomatous tumors，NSTs)中，m6A甲基转移酶VIRMA和m6A阅读蛋白YTHDF3 mRNA的表达水平有所不同。

顺铂是包括SEs在内多种肿瘤中使用最广泛的化疗药物之一。顺铂在抗肿瘤治疗中起着双重作用，在治疗的同时常伴有毒性和耐药性。Wei等[26]发现，METTL3高表达可以在耐顺铂精原细胞TCam-2中提高TFAP2C mRNA的m6A修饰水平，增强了TFAP2C mRNA的稳定性，TFAP2C的高表达与某些类型肿瘤的不良存活率相关。同时，IGF2BP1作为m6A甲基识别蛋白，也可以增强TFAP2C mRNA的m6A甲基化，而TFAP2C通过激活DNA修复基因WEE1和BRCA1，增加了该环境下TCam-2-CDDP细胞的活力，影响着细胞对CDDP治疗压力的反应。

3 总结与展望

m6a甲基化修饰通过甲基转移酶、去甲基化酶和阅读蛋白在肾癌、前列腺癌、膀胱癌和睾丸癌等泌尿系统肿瘤中起到了抑制癌基因表达或促进癌基因表达的作用，这是因为m6A修饰在RNA上有多个靶点，而各个靶点下游相关RNA和蛋白的表达机制及相互作用不尽相同。目前，以m6A甲基化为靶点的抗肿瘤治疗仍局限在某些信号传导通路或者说是某些基因上，且仍未应用于临床，主要原因在于对各条信号通路本身以及与其他通路上基因的相互作用并不清晰。

综上所述，伴随m6A修饰功能研究的逐步扩展和深入，m6A调控相关蛋白靶向药物的研发也逐渐增多，RNA甲基化修饰研究在泌尿系统肿瘤早期诊断、精准治疗、预后预测、预防复发等方面具有良好的应用前景。