溶瘤病毒在宫颈癌中抗肿瘤作用的研究进展

周 影，耿志欣，孙 建，戚小艳，裴 兵

（南京医科大学附属宿迁第一人民医院医学检验科，江苏 宿迁 223800）

宫颈癌（cervical cancer，CC）是女性死亡的主要原因之一，据世界卫生组织国际癌症研究中心报道，2020年全球约604 127例宫颈癌新发病例和341 831例宫颈癌死亡病例，其中，亚洲地区新发病例和死亡病例分别占比58.2%和58.5%[1]。高危人乳头瘤病毒（hrHPV）感染、年龄、吸烟、分娩、使用口服避孕药等因素均与宫颈癌发病密切相关，hrHPV的持续性感染是宫颈癌的主要风险因子。当宫颈上皮被hrHPV感染后，宿主的肿瘤抑制因子被沉默，促癌因子功能紊乱，基因组发生改变，从而加速了宫颈癌的癌症进展[2]。癌蛋白E5、E6和E7是由HPV基因组编码产生的蛋白，是正常宫颈上皮癌变的主要驱动因素。E6和E7分别靶向pRb和p53通路[3]，而pRb和p53通路的相互作用影响着肿瘤进展且与肿瘤的恶性表型密切相关，因此，E6、E7成为宫颈癌治疗的潜在靶点和重要攻克目标。

溶瘤病毒（OVs）是具有复制能力的病毒，它能够选择性杀死肿瘤细胞而对正常组织和细胞无损伤作用[4]。溶瘤病毒可分为两类：一类为天然病毒株，能够特异性地靶向肿瘤细胞并在其中选择性复制，如新城疫病毒、黏液瘤病毒、呼肠孤病毒等；另一类为基因工程病毒株，通过增强病毒在肿瘤细胞内发挥复制作用的基因并删除其在正常细胞中发挥复制作用的重要基因从而靶向肿瘤细胞，如单纯疱疹病毒、麻疹病毒、腺病毒等[5]。溶瘤病毒经历“野生毒株的发现和应用”“基因改造病毒株的研发”“基因插入联合治疗”这3个阶段后，现有的溶瘤病毒技术已发展至第3代，第3代溶瘤病毒发展较为成熟，不但具有肿瘤特异性，而且具有免疫调节与免疫治疗功能[6]。病毒特异性感染肿瘤细胞后使肿瘤细胞溶解，被溶解的肿瘤细胞释放肿瘤相关抗原和损伤相关的分子模式信号，这些信号进而促进机体内初始T细胞的激活和树突状细胞的浸润，进一步触发机体内获得性免疫反应和适应性免疫反应，主要包括抗病毒和抗肿瘤的免疫反应[7]。

目前，临床上越来越多地医生使用溶瘤病毒应用于癌症患者的抗肿瘤治疗，其中应用最为广泛的是溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤腺病毒等，在宫颈癌的治疗方面，也有文献报道溶瘤病毒对宫颈癌的癌症进展有抑制作用，本文对此进行综述。

1 单纯疱疹病毒（HSVs）

单纯疱疹病毒分为1(HSV-1)型和2(HSV-2)型，溶瘤HSV-1(oHSV-1)病毒开展的临床数量较多。嗜神经性的HSV-1为双链DNA病毒，由包膜、被膜、衣壳和核心等结构构成球形颗粒[8]。HSV-1基因组由2个长片段UL和2个短片段US构成，2个片段分别占比82%和18%，US和UL的多种连接方式构成HSV基因组的4种同分异构形式[9]。研究发现，HSV的同分异构体对病毒的增殖能力无显著影响。HSV-1基因可编码近100种蛋白，最先转录的基因为极早期基因（IE），IE主要包括与感染细胞蛋白（ICP）相关的基因，如ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47[10]。以ICP0为例，该基因与泛素连接酶E3功能一致，对病毒基因的表达起调控作用，它是HSV-1在正常细胞中低表达和低复制的必要蛋白[11-12]。IE的表达产物能够激活早期基因（E）和晚期基因（L）的转录，IE、E及L基因的顺序激活是HSV-1感染所必需的。此外，HSV-1能够在神经细胞中大量增殖这与ICP34.5(γ34.5)基因的存在密切相关。ICP34.5为双拷贝基因，与神经毒力有关。HSV-1在神经细胞中的增殖受到ICP34.5编码产物的影响[13]，而缺失ICP34.5基因的HSV-1优先选择在RAS蛋白活跃状态的肿瘤细胞中大量复制[14]。HSV-1病毒通过自身的包膜糖蛋白、编码一系列基因、阻断树突细胞对病原体的识别、抑制细胞的自噬和凋亡等方式逃避机体的体液免疫和宿主的抗病毒免疫监测。

G207是最早在临床试验中开展的溶瘤病毒之一，它通过删除ICP34.5基因和插入LacZ基因使得病毒在肿瘤细胞中选择性复制和传播[15-16]。G207可诱导全身抗肿瘤免疫，这与细胞毒性T淋巴细胞的激活有关。布兰克等人通过体内实验证实了低剂量的G207能够降低严重联合免疫缺陷小鼠皮下宫颈癌C33a肿瘤的体积，并且，在瘤体内注射G207后，42%的肿瘤被彻底根除[17]。

G47△是在G207基础上进行增强的3代溶瘤病毒，其基因组的最大特征是保留了G207的安全特性。该溶瘤病毒的基因组内不仅包含RL1和ICP47突变，还在编码核糖核酸还原酶大亚基的ICP6基因处插入LacZ基因使ICP功能失活，继而诱导溶瘤HSV病毒在增殖细胞中的单一性复制[4]。此外，ICP47的突变使得MHC-I表达增强，继而有效激活宿主的抗肿瘤反应。基于此，G47Δ可能比G207毒性更小且更安全[18-19]。研究者们通过体内实验验证G47Δ对实体肿瘤的影响，结果表明，G47Δ能够彻底杀死癌症干细胞，包括肝细胞癌、神经鞘瘤、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌等[18]。KAGABU M等人对G47Δ在宫颈癌中的效应进行探索，研究发现，G47Δ对三株宫颈癌细胞株（SKGⅢa）均有杀伤能力，且在HeLa宫颈癌细胞异种移植模型中，G47Δ明显抑制肿瘤体的生长，且与对照组相比，G47Δ治疗组小鼠体内CD8+T细胞前体数量显著增加[6]。

2 腺病毒（Ads）

腺病毒是150 nm左右、无包膜的双链DNA病毒颗粒，其大小约为36 kb，能够编码早期和晚期基因。Ads的衣壳由3种主要蛋白质（六邻体、五邻体碱基和纤维）和4种次要蛋白质（Ⅲa、Ⅵ、Ⅷ和Ⅸ）组成[20]。病毒感染细胞时，Ads的纤维结构域与细胞表面受体相互作用，病毒通过五邻体碱基上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）基序与细胞整合素（主要是αV3和αV5）结合而内化进入细胞。在衣壳中，Ads的早期和晚期基因在宿主细胞核中转录，促进病毒的装配并从细胞中释放。因为Ads在人群中广泛存在，机体内含有Ads相关的抗体，这是溶瘤Ads的一大缺点，研究者们通过应用蜂窝载体、聚合物包裹Ads等方式解决了这一问题[21]。人类细胞表面的Ads受体为整联蛋白受体，它们可以转导和感染分裂和非分裂细胞等多种细胞类型。Ads载体在机体内以游离DNA形式存在，确保其不会整合至宿主的基因组中，这是Ads安全性的体现。新一代Ads载体能够装载高达37 kb的外源基因，这为腺病毒在临床的应用提供更多可能。Ads自身具有强大的免疫原性使其成为溶瘤应用地理想物质，溶瘤Ads通过基因编辑后在正常组织中的复制减少，在肿瘤细胞中的复制持续增加，使得癌细胞被裂解。一旦被感染的肿瘤细胞被裂解，肿瘤细胞释放的病毒后代会感染邻近的癌细胞，血液也成为病毒颗粒的“助手”，协助其在体内完成远处转移[20]。溶瘤病毒还通过释放肿瘤相关抗原来诱导针对肿瘤细胞的免疫反应[22-23]。

Ad5-Δ24RGD溶瘤病毒，在其基因组中，E1A蛋白结构域的恒定区2有24 bp的缺失，E1A蛋白这一结构域赋予Ads诱导细胞进入S期的能力。因此，E1A蛋白结构域缺失部分碱基片段后使得细胞无法进行增殖。此外，有研究称肿瘤组织中柯萨奇 - 腺病毒受体（CAR）表达降低，为了避免宫颈癌中CAR的缺陷和提高Ad5-Δ24RGD在肿瘤治疗过程中的效应，Suzuki K等人将结合了精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸 (RGD-4C)基序的 αvβ3及 αvβ5整合素合并到旋钮域的HI循环上[24]。Pasqualini R等人证实RGD及RGD修饰的Ads能够与肿瘤细胞自身表达的αvβ3和αvβ5有效结合，并且，RGD修饰已被证实可以在体内和体外对癌细胞的转移发挥治疗作用[25]。Ad5-Δ24RGD体外对宫颈癌细胞具有溶瘤活性且对小鼠晚期宫颈癌有治疗作用，在评估Ad5-Δ24RGD是否能够抑制宫颈癌的转移过程中发现，静脉注射一定剂量的Ad5-Δ24RGD可以有效减少瘤体的生长且无毒性作用[23]。

M6是源自野生型腺病毒血清型5的新型E1A突变的溶瘤腺病毒。M6的E1A CR2区域内有27 bp的缺失，使得该溶瘤腺病毒能够广泛地在肿瘤细胞中进行选择性复制。M6中的另一个生物工程组件是将反义HPV16 E6 E7 DNA插入E3 6.7K/gp19K区，促进反向HPV16 E6 E7 cDNA优先在HPV相关宫颈癌细胞中表达，从而沉默HPV16 E6 E7蛋白。在HPV相关的宫颈癌细胞中，pRb被HPV癌蛋白E7功能性灭活，且M6的病毒复制将放大HPV相关宫颈癌细胞中反义 HPV16 E6 E7的拷贝，并允许病毒感染扩散到附近的肿瘤细胞。WANG W等人通过体内体外实验证实了经由M6转染的SiHa细胞（一种HPV阳性宫颈癌细胞）中HPV16 E6、E7蛋白的表达受到特异性抑制，此外，M6转染在SiHa细胞中显著诱导凋亡[3]。

3 新城疫病毒（NDV）

新城疫病毒（NDV）为单股负链RNA病毒，是天然溶瘤病毒之一，隶属于副黏病毒亚科的禽副黏病毒属[26]。NDV毒株包含3种无毒力减毒毒株，分别为Ulster、LaSota和 Hitchner B1毒株。NDV基因组的6种结构基因可以编码6种结构蛋白，分别为核蛋白、磷蛋白、融合蛋白、基质蛋白、血凝素神经氨酸酶蛋白和RNA聚合酶蛋白。NDV感染宿主过程中，血凝素神经氨酸酶蛋白和融合蛋白发挥主要作用，前者对细胞受体的识别、对病毒吸附细胞膜的介导作用及后者促进病毒与宿主细胞膜的融合、促使病毒穿过细胞膜进入细胞[27-28]。研究发现，NDV对肿瘤的治疗作用主要归因于以下几点：①NDV在肿瘤细胞中增殖并对其进行裂解，以完成对肿瘤细胞的直接清除[29]；②血凝素神经氨酸酶蛋白既能够使肿瘤细胞表面抗原充分暴露又能够增强肿瘤细胞对淋巴细胞的黏附力，以激活机体的细胞和体液免疫反应[30]；③由NDV刺激产生的IFN-α、TNF-α、IL、集落刺激因子等细胞因子激活NK细胞、巨噬细胞和致敏T细胞，以发挥ADCC效应、破坏肿瘤细胞、特异性杀伤肿瘤细胞的作用[31]；④NDV抑制肿瘤微血管的形成切断肿瘤细胞的营养供给，最终达到间接杀伤肿瘤细胞的作用[32-33]。

KESHAV RZ M等人使用表达人乳头瘤病毒16(HPV-16)E6/E7癌蛋白的宫颈癌TC-1细胞系开展NDV的溶瘤效果研究，他们发现，溶瘤NDV LaSota菌株在转化细胞中优先复制、产生ROS、激活早期细胞凋亡途径等方式诱导宫颈癌TC-1细胞的凋亡[34]。据NEJAD A SM等人报道，HB1 NDV毒株的感染可通过上调caspase-3和LC3 - Ⅱ的表达，以剂量依赖的方式诱导癌细胞的凋亡和自噬。此外，NEJAD A SM等人还发现NDV能够诱导ROS的产生、增加细胞色素C的水平及下调存活蛋白水平，最终发挥抗肿瘤的治疗效果[35]。

4 辛德毕斯病毒（SIN）

辛德毕斯病毒（SIN）是隶属于披膜病毒科甲病毒属的单股正链RNA病毒[36]。SIN基因组进入细胞后翻译成4个非结构蛋白和5个结构蛋白，非结构蛋白主要包含Nsp1、Nsp2、Nsp3、Nsp4，结构蛋白主要包含衣壳蛋白C、E3多肽、E2糖蛋白、6K多肽和E1糖蛋白。Nsp1与宿主细胞膜相互作用，继而与内涵体和溶酶体亲和，这表明Nsp1与RNA复制子复合体的形成密切相关；Nsp2蛋白内包含几个重要的突变位点，对病毒的复制和转录至关重要；E2和E3的突变致使SIN感染性恢复和毒性增加。研究发现，SIN在受感染的哺乳动物细胞中可能诱导凋亡[37-38]。

将外源序列与编码口蹄疫病毒2A蛋白酶的基因相连后插入SIN病毒衣壳与E3基因之间的框架内，这是表达融合蛋白的重组SIN病毒，在2A蛋白酶的作用下，该融合蛋白与绿色荧光蛋白相连成为表达GFP的重组SIN病毒（TR339-GFP/2A）[39]。UNNOY等人通过体内、体外实验探索TR339-GFP/2A病毒对宫颈癌疾病的作用，结果表明，TR339-GFP/2A对正常人角质形成细胞的凋亡无诱导作用，而对宫颈癌细胞HeLaS3和C33A有诱导病变和促进凋亡的作用；在裸鼠中，静脉注射TR339-GFP/2A后，异种移植的宫颈癌瘤块体积减小甚至消退，对裸鼠进行解剖后发现，TR339-GFP/2A可致远处肿瘤的坏死；GFP蛋白成像系统表明TR339-GFP/2A对肿瘤具有特异性靶向的作用[40]。

溶瘤病毒疗法是治疗恶性肿瘤的新型实验方法，通过对其基因组进行编辑以提高其抗肿瘤效果，包括：靶向肿瘤细胞和插入特定的治疗性转基因，该病毒对正常组织和细胞无作用而能够特异性地靶向肿瘤细胞并抑制肿瘤细胞的增殖或诱导其凋亡，最终发挥抗肿瘤的作用[41]。纵观溶瘤病毒的发展史，小核糖核酸病毒Rigvir是国外第一个获批用于癌症溶瘤治疗的产品[42]；上海双威生物科技有限公司开发的H101是国内首个获得GMP证书的溶瘤病毒，该病毒可用于鼻咽癌联合化疗，且于2006年成功上市[43]，但H101的临床疗效未得到国际认可；用于黑色素瘤患者局部治疗的HSV-1型溶瘤病毒T-vec是首个获得国际认可的溶瘤病毒[44]。在宫颈癌的溶瘤治疗方面，目前已获得临床许可的仅有重组人PD-1抗体HSV，可用于实体肿瘤的治疗[45]。

上文所述的几种溶瘤病毒虽尚无相关的临床研究报道其对宫颈癌的抗肿瘤效应，但其在其他疾病中的作用已进入临床试验阶段，例如：FRIEDMAN GK等人通过队列研究验证了G207在儿童胶质瘤治疗过程中的抗肿瘤作用[46]，结果表明，G207对延长胶质瘤患者生存期有显著作用；G47Δ明显改善恶性、复发性神经胶质母细胞瘤患者的预后，并将其年生存率提高至92.3%，这是G47Δ抗肿瘤特性的直接证据。虽然目前溶瘤病毒用于癌症治疗尚处于初步阶段，但我们在大量基础实验中看到其作为临床靶向肿瘤治疗的巨大潜力，伴随着临床试验的相继开展，溶瘤病毒有望成为治疗人类原发性和转移性癌症的新兴药物。

5 结语

溶瘤病毒在抗肿瘤的过程中诱导机体出现特异性抗肿瘤免疫反应，因此，在未来的研究中将其与免疫疗法相结合，有望进一步提高其疗效。通过对溶瘤病毒的基因组进行编辑，研究者们也将会开发出更多具有抗肿瘤功能的溶瘤病毒，并且可以针对癌症的类型和阶段选择合适的病毒基因组编辑方式。最后，希望溶瘤病毒这一新型疗法能够改善宫颈癌患者的预后，能够降低亚洲地区宫颈癌疾病的致死率。