干细胞与生物起搏的研究进展

陈雅婷，张建成，李 泱

目前，对于病态窦房结综合征等严重缓慢性心律失常的治疗策略主要是植入人工心脏起搏器，通过人工产生的电脉冲来控制心脏的跳动。虽然拯救了无数病人的生命并提高了其生命质量，但仍存在一些缺点和局限性，包括感染、金属过敏、电极脱位、电子干扰和缺乏神经激素反应性。因此，“心脏生物起搏”已成为探究缓慢性心律失常治疗的新方向。本研究结合近年来国内外最新文献报道，对干细胞与生物起搏的研究进展进行综述。

1 干细胞的研究现状与进展

心脏生物起搏是指利用细胞分子生物学及其相关技术，对机体受损的自律性节律点或特殊传导系统的细胞进行修复或替代，从而构建“生物起搏器”，得以恢复心脏的起搏和传导功能，并从心脏生理功能和人体适应性的角度，避免了传统电子起搏器的缺陷和严重并发症，是迈向基于自体干细胞更理想的疗法[1]。心脏生物起搏器的构建是今后的重要发展方向，其基础和关键是找到理想的种子细胞。目前，用于构建心脏生物起搏的细胞主要为干细胞：包括胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。为了能够从干细胞中分离获得更多、更纯的起搏样细胞，大量研究聚焦于转化因子促进干细胞向起搏样细胞的诱导分化和阶段性调控相关窦房结发育生物学信号级联反应诱导干细胞分化为起搏样细胞。

2 干细胞与生物起搏

2.1 ESCs与生物起搏 ESCs作为原始胚胎中的一类细胞，具有多向分化、无限增殖且自我更新的特性[2]。当ESCs诱导分化为具有起搏功能的心肌细胞时，有效地提高ESCs衍生心肌细胞的总产量和富集纯的心肌细胞变得尤为重要。ESCs来源的心肌样细胞一般是从胚状体中跳动区域分离得到的，这些早期的心肌细胞具有起搏细胞的特性，可作为构建生物起搏器的种子细胞，但这些细胞的数量少、纯度不理想。为了能够从ESCs中分离获得更多、更纯的起搏样细胞，ESCs诱导分化的研究陆续展开。

2.1.1 ESCs分化与转化因子 为了能够从ESCs中分离获得更多、更纯的起搏细胞，大量研究聚焦于操纵Shox2、Tbx、HCN等转录因子及起搏基因的表达来促进ESCs向起搏样细胞的诱导分化。Ionta等[3]直接将Shox2基因转染至小鼠ESCs(mESCs)，诱导分化获得起搏样细胞并成功构建了生物起搏器。Scavone等[4]研究发现，ESCs中CD166+的细胞可发育为窦房结样细胞，这些细胞可高表达参与窦房结细胞发育的相关基因Tbx18、Tbx3、Isl-1和Shox2等，以及相关功能基因Cx30.2、HCN4、HCN1、CaV1.3等，并低表达心室肌基因Cx43、Kv4.2、HCN2、Nkx2.5，且与小鼠的窦房结细胞形态相似并具有起搏特性，与新生大鼠心室肌细胞共培养表现出更快的跳动频率，这揭示了CD166+可作为筛选窦房结样细胞的重要细胞外标志蛋白。Hoffmann等[5]在此研究基础上，为了验证窦房结细胞中Shox2依赖性的发育机制，通过5种不同的窦房结样细胞诱导方案，从分离出Shox2+CD166+和Shox2-CD166+窦房结样细胞中发现，Shox2+CD166+窦房结样细胞表达有更多的窦房结标志基因，表明仅以CD166+作为有效富集纯化窦房结样细胞的标记仍有不足，且目前尚未有CD166+ESCs的在体动物研究结果，值得进一步的探究。Jung等[6]将人Tbx3和Myh6启动子相结合构建稳定的组成型Tbx3过表达mESCs，其衍生的心肌细胞聚集体中>80%在蛋白质表达和电生理参数上具有起搏器表型所需的功能特征，且每分钟的搏动频率达300～400次。Saito等[7]将兔HCN4基因转染至小鼠ESCs，诱导分化为mESC-CMs，产生快速的自发搏动和起搏电流，且对起搏电流抑制剂伊伐布雷定和激动剂异丙肾上腺素有生物反应性，在体外与其他可兴奋细胞共培养具有同步收缩起搏能力，可用于生物起搏器的构建。

2.1.2 ESCs分化与发育生物学信号通路的调控 研究表明，通过调控窦房结发育生物学的相关信号通路来诱导ESCs分化为窦房结样细胞。Zhu等[8]通过调控NRG-1β/ErbB信号传导来调节hESC-CMs分化培养物中的窦房结样细胞与工作型心肌细胞的比例，发现NRG-1β/ErbB信号的抑制可增加具有窦房结样细胞的比例，同时降低工作型心肌细胞。Birket等[9]发现在诱导ESCs分化为心肌细胞过程中，可分为Nkx2.5阳性表达(Nkx2.5+)的工作心肌细胞和Nkx2.5阴性表达(Nkx2.5-)的窦房结样起搏细胞，后者表达高水平窦房结发育相关基因及起搏离子通道基因，电生理检测记录到窦房结细胞样的动作电位及起搏电流，当培养到30 d，Nkx2.5-细胞群依然保持着起搏细胞的特征和搏动频率。Protze等[10]通过骨形成蛋白-4(BMP4)、视黄酸(RA)和成纤维细胞生长因子抑制剂(FGFi)的序贯诱导提高Nkx2.5-hESCs的比例，且在Nkx2.5-hESCs中记录到舒张期去极化的动作电位，起搏电流If、ICa，T、Ik，ATP，其对β受体激动剂和抑制剂具有良好的生物反应性，将富集到的Nkx2.5-hESCs移植到大鼠的左室心尖部，能够成功起搏用药物诱导出房室传导阻滞的心脏，并用Optical mapping技术记录到起搏点源于移植部。Liang等[11]通过添加激活经典Wnt/β-catenin信号传导的外源性Wnt3a配体，可增加起搏器样心肌细胞的产量，起搏器表型伴随着窦房结样细胞的特异性基因和基因产物的表达而增强，同时减少肌钙蛋白T(cTnT)阳性心肌分化，此结果表明Wnt/β-catenin途径是ESCs分化过程中心肌亚型发生的关键决定因素：内源性Wnt信号传导的激活有利于起搏器谱系的表达，而其抑制则促进了室性心肌细胞谱系。此外，研究表明，苏拉明、内皮素-1和钙激活的钾通道可促进胚胎干细胞诱导分化为窦房结样细胞，窦房结特异性标志物表达水平显著上调[12-15]。

关于ESCs的研究证实了ESCs可以诱导分化为起搏样心肌细胞，并用于心脏生物起搏器的构建，但这些细胞始终存在伦理学的问题，且免疫原性、成瘤性问题也一直受到关注。此外，精确调控ESCs定向诱导分化、纯化等问题尚需解决。

2.2 MSCs MSCs是一种非造血的基质细胞，根据来源主要分为骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)和脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，具有自我更新和多向分化潜能，且获取相对容易，可取自病人自身，不存在组织相容性问题，适宜自体移植等优点，成为生物起搏的种子细胞。然而，MSCs不具有电生理活性但表达缝隙连接蛋白，向起搏细胞的分化相对困难，更多的研究将MSCs作为一种目的基因的载体，通过转染起搏基因或调控窦房结分化的转录因子可获得起搏样细胞，与周围心肌形成电偶联发挥生物起搏功能[16]。

2.2.1 MSCs分化与起搏基因 早期研究多转染单个起搏基因构建生物起搏器，Cheng等[17]将小鼠的HCN4转染至犬间充质干细胞(cMSCs)，从而产生Cs+敏感的起搏电流，将所转染的3×106cMSCs注射至右心室心外膜下，发现注射部位自发产生心室节律，搏动频率为(45±9)次/min，表明基因修饰的cMSCs可以在体外和体内表达功能性HCN4离子通道，作为心脏传导系统重要的起搏基因。Darche等[18]将起搏HCN4转导入人类BMSCs和ADSCs并与新生大鼠心室肌细胞共培养以促进起搏样细胞的诱导分化，2周后，转染的人类ADSCs表现出更早的自发性收缩和更快的搏动速率且具有规律性和同步性，同时产生具有心脏起搏器组织特征的离子通道(CaV1.2，NCX1)、转录因子(Tbx3，Tbx18，Shox2)和缝隙连接蛋白(Cx31.9，Cx45)。Wei等[19]用同样的方法获得窦房结样细胞，在Ⅲ度房室传导阻滞模型犬左室前壁进行注射，连续6周观察后发现，起源于移植部位的平均自主节律[(59±5)次/min]较未移植对照组[(38±2)次/min]明显上升，且具有心律变异性。但是，随着时间的推移，源自移植部位的自主节律开始逐渐下降。究其原因，可能与移植细胞的凋亡、流失或未能与周围心肌细胞形成良好的电机械偶联有关。Yang等[20]用携带小鼠钙激活钾通道的SK4基因的重组腺病毒载体转导ADSCs，体外培养5～7 d后将转导的ADSCs植入大鼠左心室游离壁，2周后，在离体的灌流大鼠心脏中建立完全性房室传导阻滞，移植部位产生了异位节律并承担了生物起搏器的

功能；同时，SK4在ADSCs中的稳定地表达促进ADSCs的分化，Shox2和HCN4的表达上调，产生起搏电流且可被CsCl所抑制，以及诱导了p-ERK1/2和p-p38 MAPK的表达。这揭示了p38-MAPK和ERK1/2信号通路的激活可促进起搏样细胞的诱导分化，为心脏生物起搏器的构建提供了新思路。

2.2.2 MSCs分化与转录因子 近年来的研究聚焦于转染窦房结发育相关的转录因子，可促进BMSCs或ADSCs向窦房结样细胞诱导分化，窦房结特异性标志物表达增加并产生起搏电流。张健等[21]将过表达胰岛素基因增强子结合蛋白1(insulin gene enhancer binding protein-1，ISL-1)的ADSCs与乳鼠心室肌细胞共培养7 d促进起搏样细胞的诱导分化，发现窦房结特异性基因表达上调，同时工作心肌特异性基因表达下调，且大多数细胞可记录到起搏电流，表明ADSCs经单一转录因子ISL-1的基因修饰可在体外心肌微环境中，诱导产生窦房结样细胞。Feng等[22]将Shox2转染至犬BMSCs并与乳鼠心肌细胞共培养7 d以上，诱导分化为起搏样细胞，高表达起搏基因Tbx3、HCN4、Cx45，而低表达心室基因Nkx2.5和Cx43，且可在体外快速起搏乳鼠心室肌细胞。Hu等[23]将Tbx18转染至猪BMSCs促进起搏样细胞的诱导分化，细胞形态由纺锤形变化为条带状，在第10天，约7%的BMSCs-Tbx18中观察到了搏动，搏动频率约为90次/min，并且该搏动可以在体外持续约3周，同时Tbx18、肌钙蛋白I(cTnI)、HCN4、α-SA的表达增加，将转导的BMSCs植入猪右心室并成功起搏窦房结功能障碍的心脏，且对β-肾上腺素能激动剂有反应性。Zhang等[24]通过将转录因子的组合(ISL-1和 Tbx18)共同转染脂肪干细胞，再与新生大鼠心室肌细胞体外共培养7 d后，诱导ADSC成功分化为起搏样细胞。更多的研究在体外证实，通过多种方法将Tbx18转染至BMSCs或ADSCs可促进其向窦房结样细胞诱导分化，窦房结特异性标志物表达增加并产生起搏电流。由于BMSCs和ADSCs不具有电生理活性，本身并不具备起搏细胞的结构基础，鉴于窦房结电生理特征的复杂性，单一的导入起搏基因所构建的起搏样细胞特性与窦房结细胞仍有明显的差异，但要更加接近生理性的窦房结细胞功能，需要转导大量的离子通道基因和相关转录因子，这是很大的工程，难以付诸实践。

2.3 iPSCs iPSCs是通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。2007年Takahashi等[25]通过4种特定转录因子Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc的转染将人皮肤成纤维细胞重编程为iPSCs，自此揭开了人体细胞重编程的帷幕，也迅速成为干细胞领域的研究热点。iPSCs获得方法相对简单并且稳定，可取自自体细胞，不需要使用卵细胞或者胚胎，跨越了细胞移植所带来的免疫排斥、伦理争议等问题。此外，iPSCs在形态学、表面标志物及端粒酶活性等方面与ESCs具有相似性，且在多种转化方法的应用下，可大大降低非定向分化导致的致瘤性。这些特性使iPSCs相较于成体干细胞移植，能够更好地整合到宿主心脏组织中。

Mandel等[26]对诱导iPSCs来源的心肌细胞(iPSC-CMs)进行连续15 d的观察记录，发现其搏动频率非常稳定，具有一定的节律变异性，对乙酰胆碱和β-肾上腺素刺激存在生物反应性，但起搏频率仅为30～50次/min，表明iPSC-CMs具有一定的起搏功能。Chauveau等[27]首次使用源自人的iPSC-CMs创造了一种生物起搏器，将40～75个由自发搏动的iPSC-CMs组成的节律收缩的胚状体注射到左心室，在完全性心脏传导阻滞犬模型中可以在体内与心室肌整合，从而构建心脏生物起搏器，但iPSC-CMs心脏起搏器的速度和节奏仍有待优化。

研究表明，不同的诱导方法获得的iPSC-CMs的搏动频率也不尽相同；同时也有研究表明，在干细胞衍生的心肌中，存在着一些细胞具有窦房结细胞的特征，但这种细胞的比例较少，甚至是一过性的[28]。因此，寻找新的诱导方法促进iPSCs分化为高表达窦房结特异性基因、高纯度且具有起搏功能的窦房结样细胞，已成为构建生物起搏器亟须解决的问题。

2.3.1 iPSCs分化与转录因子 胚胎期的转录因子能够从窦房结发育的上游信号通路调控细胞的发育，导入窦房结细胞转录因子可调控iPSCs更多地向窦房结样细胞分化。王芸等[29-30]分别将Tbx18用不同的方式转染至hiPSC-CMs促使其向起搏样细胞诱导分化，发现起搏特异性基因HCN4表达上调，心室肌特异性基因如钠电流(SCN5A，INa)、内向整流钾电流(Kir2.1，IK1)、CX43表达下调，从而表明Tbx18基因的传递具有开发生物起搏的潜力，能够促进hiPSC-CMs分化为起搏样细胞。Zhao等[31]将Tbx3和HCN2共同转染hiPSC-CMs以重编程为起搏样心肌细胞，工作型心肌细胞特异性标志CX40、CX43、SCN5A、Kir2.1的表达下调，而窦房结细胞特异性标志CX30.2和CX45的表达增加，并产生窦房结细胞样的动作电位和起搏电流。Tbx3和HCN2的共表达促使舒张期最大

去极化电位以及起搏电流的产生，其协同作用产生起搏细胞的最典型特征——自发性舒张期去极化，为构建生物起搏器提供新策略。Gorabi等[32]将Tbx18转染的hiPSC-CM产生的起搏样细胞注射到大鼠的左心室前外侧壁，进行心脏离体实验构建完全性心脏传导阻滞后，心率显著增加、心室纤颤持续时间较少，且上调HCN4表达及下调Cx43表达，故通过细胞和基因治疗策略导入Tbx18基因后，可证明功能性起搏器的形成。

2.3.2 iPSCs分化与发育生物学信号通路的调控 Protze等[10]通过对发育信号通路的阶段性调控，诱导人多能干细胞分化为窦房结样起搏细胞，该研究基于Nkx2.5表达与否将心肌细胞进行分类，结果显示Nkx2.5-的细胞可高表达窦房结细胞特异性标志物，并可记录到起搏电流，将其移植至房室传导阻滞模型大鼠的心尖部位，可有效起搏心脏周围的组织，进而证明其具有生物起搏功能。通过该方法诱导的起搏样细胞数量多、纯度高，为iPSCs成功构建生物起搏提供了新的借鉴，但生物起搏的效果需要进行大型动物的相关研究。Ren等[33]揭示经典的Wnt信号传导在指导中胚层细胞命运决定的基因调控上发挥作用，促使起搏细胞的分化。在斑马鱼中，起搏器心肌细胞衍生自Nkx2.5+中胚层的一个子集，该子集对典型Wnt5b信号做出响应以启动心脏起搏器程序，包括心脏起搏器细胞分化转录因子Isl-1和Tbx18的激活以及Nkx2.5的沉默。通过发现起搏器心肌细胞的起源，揭示了进化上保守的Wnt信号传导机制，该机制协调了指导中胚层细胞命运决定的基因调控变化，从而导致起搏器心肌细胞的分化。研究发现通过小分子抑制剂CHIR99021处理，在分化的第5天能重新激活心脏祖细胞经典Wnt信号传导，可促进TNT2起搏样心肌细胞的分化且起搏特异性基因表达增加，表明Wnt5b信号在体外可促进hiPSC起搏样心肌细胞的诱导分化，为心脏生物起搏治疗提供了潜在的策略。与此同时，虽然此研究与协同操纵的多个信号通路诱导起搏样细胞的研究不同，但在心脏发育过程中重新激活经典的Wnt信号传导，可能通过协调阶段性的信号传导级联反应来介导心脏起搏器细胞的发育，该信号传导级联反应可能包括BMP信号传导和其他信号传导途径(FGF和RA)指导心脏祖细胞趋向于心脏起搏器的命运，且抑制了它们分化为其他心肌细胞类型[10]。

3 小 结

心脏生物起搏器的构建可通过转化因子和窦房结发育生物学信号级联的调控等方式促进干细胞向窦房结样细胞诱导分化，作为病态窦房结综合征及Ⅲ度房室传导阻滞等严重缓慢性心律失常一种新型的细胞治疗手段，具有独特的优势。如今，起搏样细胞的诱导分化仍困难重重，探索路程漫长而任重道远。但是，生物起搏器替代电子起搏器仍是未来的发展方向，相信在不远的将来，通过不断的实验研究，心脏生物起搏器可以安全有效地应用于缓慢型心律失常病人的临床治疗当中，为人类带来福音。