高通量测序在乳腺癌及妇科恶性肿瘤筛查中的应用进展*

李 敏，豆小文 综述,张秀明△ 审校

1.安徽理工大学医学院，安徽淮南 232000；2.深圳市罗湖区人民医院医学检验科，广东深圳 518001

乳腺癌(BC)及妇科恶性肿瘤(如子宫颈癌、输卵管肿瘤、子宫内膜癌和绒毛膜癌等)是遗传和获得性突变、转录偏差和表观遗传因素影响的基因组改变的结果[1-6]。了解BC及妇科恶性肿瘤的基因组和分子基础对发现用于筛查和预防的生物标志物及开发更有效的药物靶点治疗策略至关重要。运用传统的Sanger测序技术(即第一代测序技术)分析实体肿瘤的遗传表征仅涉及小且单一的DNA片段分析，对于同时进行多个基因的测序是有限、耗时且昂贵的[7]。高通量测序技术(NGS)又称“下一代”测序技术，允许在一次分析中同时对数千至数百万个DNA片段进行测序，从而扩大了所获取的遗传信息数量，减少了分析的时间和成本[8]。在BC及妇科恶性肿瘤中，NGS的使用在高风险遗传基因的识别等方面产生了重要的作用[9]，本文就NGS对BC及妇科恶性肿瘤的早期筛查和预防、诊断和治疗策略等方面的影响作一综述。

1 NGS平台

目前，瑞士罗氏公司的454 测序仪、美国Ⅰllumina公司的Solexa基因组分析仪和ABI公司的SOLiD 测序仪为NGS平台的代表。

1.1454测序仪 454测序仪运用焦磷酸测序方法即结合乳液聚合酶链反应和皮升级焦磷酸为基础方法，依靠生物发光进行基因测序。其原理是在DNA聚合酶、荧光素酶、腺苷三磷酸(ATP)硫酸化酶和双磷酸酶的协同作用下，将每一个脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的聚合与一次荧光信号偶联起来，通过检测荧光信号的有无和强弱，进行实时检测DNA序列[10-11]。454焦磷酸测序技术不需要进行电泳，也不需要荧光标记的引物或核酸探针，具有灵敏度高、分析速度快和自动化等优点。

1.2Solexa基因组分析仪 Solexa基因组分析仪运用单分子阵列，通过边合成边测序技术检测DNA序列。其原理是将已加入接头的DNA片段附着到含接头测序芯片表面，经过延伸和桥式扩增后，在芯片上形成了数以亿计的核苷酸片段，每组核苷酸片段是具有数千份相同模板的单分子簇。通过检测带荧光基团的4种特殊dNTP加入到引物后释放出的焦磷酸盐信号来确定DNA序列[12-13]。边合成边测序技术可减少因二级结构而造成的片段缺失，具有高通量、高灵敏度、自动化、操作简单等优点。

1.3SOLiD 测序仪 SOLiD测序仪运用寡核苷酸连接测序技术进行“双碱基”DNA测序。其原理是在连接反应体系中，将5′端带有4种荧光染料(CY5、Texas Red、CY3、6-FAM)的8碱基探针混合物与目标DNA模板按碱基互补配对原则配对连接，通过发出的荧光信号检测DNA序列。另外，8碱基DNA探针的3′端第1、2位构成的碱基对编码表达荧光染料基因，第3～5位是随机碱基，第6～8位为可以和任何碱基配对的特殊碱基[14-15]。在反应过程中，SOLiD测序仪记录第1、2位编码区荧光颜色信息，并用化学法去掉第6～8位碱基及荧光基团，依次循环组成原始颜色序列。SOLiD“双碱基”DNA测序可用于判断检测位点是否为单核苷酸多态性，具有无可匹及的准确性、高通量、系统灵活、操作简单等优点。

2 NGS筛查BC及妇科恶性肿瘤

目前，NGS在BC及妇科恶性肿瘤的临床筛查方面应用较少，但其在发现药物治疗新靶点及耐药的分子机制方面具有重大意义，是临床研究的热点之一。

2.1NGS在BC中的应用 BC病理组织形态较为复杂，分型分类众多。根据基因表达谱，BC可分为腔型A型、腔型B型、人表皮生长因子受体2(HER2)阳性型、基底细胞样型、未能分类型[16-18]；按免疫组化结果可分为雌激素受体(ER)/孕激素受体(PR)阳性、HER2阳性和三阴性BC(ER、PR、HER2均阴性)，大致对应的基因表达谱分型为：腔型A型和B型、HER2阳性型、基底细胞样型。因此，可利用NGS对不同分型的BC患者进行基因测序，协助临床医生实现疾病的早筛、及时调整治疗方案。HAN等[19]研究结果表明，NGS可检测包括乳腺癌1号基因(BRCA1)启动子区域缺失以及单核苷酸变异和小的插入、缺失在内的大多数基因重排，并通过仔细评估患者的病史、RNA测序和基因表达，证明了启动子区域缺失的重要性。BRCA1启动子区域的缺失显著，可将其纳入遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征患者的遗传筛查。NASSAR等[20]利用NGS检测BC体细胞基因突变，结果表明，除之前已报道的TP53、PIK3CA、PTEN等常见基因外，还发现了KRAS、STK11、APC、JAK3等其他基因的突变。可见，NGS是评估BC癌基因和抑癌基因突变状态的一个非常有用的工具。

2.2NGS在宫颈癌中的应用 宫颈癌是发病率最高的妇科恶性肿瘤，其早期筛查以高危型人乳头瘤病毒(HPV)检测联合液基薄层细胞学检测(TCT)为主[21-23]。携带高危型HPV但不罹患宫颈癌的女性也并非少数。对于宫颈癌患者来说，NGS可获得其免疫治疗标志物信息；对于高危型HPV携带者来说，可预测病毒是否会持续感染、是否会进一步发展为宫颈癌。FERTEY等[24]利用NGS检测高危型HPV16 L1基因组中胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点(CpG)5962的甲基化水平，证明该位点的甲基化可能是HPV持续感染的预测标志物，且特异性CpG的甲基化与高危病毒载量之间存在相关性。有研究利用NGS观察到显著的APOBEC基因突变模式，并证实了SHKBP1、ERBB3、CASP8、HLA-A和TGFBR2是宫颈癌新的显著突变基因[2]；在所有HPV18阳性患者和76%的HPV16阳性患者中发现HPV整合，可能与结构畸变和靶基因表达水平增高有关。上述有关甲基化检测以及HPV整合位点分析的研究有望对高危型HPV进一步分型，并揭示了宫颈癌新的潜在治疗靶点。

2.3NGS在卵巢癌中的应用 卵巢癌是病死率极高的一种疾病，在疾病早期患者通常无明显症状，在出现临床症状时病情往往已处于晚期阶段。约70%的卵巢癌为卵巢高级别浆液性腺癌，此类卵巢癌很少原发于卵巢，而大部分发源于输卵管[25-27]。目前虽采用糖类抗原125检测联合盆腔超声对散发的卵巢癌进行筛查，但无法实现早期诊断。对于家族性的卵巢癌，通过基因检测可使患者在尚未发病时就预防性切除卵巢[20]。此外，ZHENG等[28]运用NGS在化疗敏感和不敏感卵巢癌患者中鉴定出249个差异表达基因，这些与化疗敏感性相关的关键基因表达水平可以作为预测治疗结果和改善预后的靶点。

2.4NGS在子宫内膜癌中的应用 子宫内膜癌的筛查及诊断方法有血清学检测、影像学检查、组织病理学检测等，但高危子宫内膜癌患者多合并有肥胖，增加了活检的难度[29-31]。随着分子生物学技术的发展，组织病理学检测与基因检测相结合的方式有望实现子宫内膜癌的临床早期筛查，并发现基因突变的子宫内膜癌患者。WILSON等[32]研究发现ARID1A、PIK3CA两种基因同时突变与子宫内膜癌的发生直接相关。SANGTANI等[33]收集从子宫内膜癌患者使用过的阴道卫生棉条上脱落的DNA，采用低覆盖全基因组测序评估拷贝数、焦磷酸测序测量启动子甲基化水平，通过NGS确定了19个与子宫内膜癌相关的基因突变，其灵敏度为92%，特异度为86%，为子宫内膜癌非侵袭性且精确的检测方法提供了依据。

2.5NGS在绒毛膜癌中的应用 相较于上述3种常见的妇科恶性肿瘤，绒毛膜癌发病率虽较低，但其预后不良，易通过血行转移至其他组织器官，导致患者死亡。并且其诊断方法仅为影像学检查、病理组织学检测等，无法实现早期无创筛查，因此，针对绒毛膜癌的基于NGS的基因突变研究逐渐开展起来。高达20%的完全性葡萄胎可发展为妊娠滋养细胞癌，其中就包括绒毛膜癌。目前尚无成熟的生物标志物能够预测妊娠滋养细胞癌的发展，LIN等[34]运用NGS检测绒毛膜癌细胞系(JEG-3和JAR)和正常胎盘细胞系(3A-subE)的微小RNA(miRNA)，检测结果显示JEG-3和JAR中miR-181b-5p和miR-181d-5p均有明显改变，并且均表达BCL2蛋白，提示miR-181家族成员和BCL2蛋白可能是预测妊娠滋养细胞癌变风险的生物标志物。

3 小 结

随着精准医疗的发展，女性恶性肿瘤的早期筛查成为临床亟待解决的问题之一。相对于传统的组织病理学检测、血清学检测、影像学检查等手段，NGS有着较高的灵敏度和准确性。目前，NGS检测的DNA标本可以来自子宫腔脱落细胞、宫颈管细胞涂片甚至是外周血等，以循环肿瘤DNA和甲基化的检测为发展方向，NGS可实现BC、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌等女性恶性肿瘤的无创早筛。