外源性重组激活基因在人类细胞中的表达研究①

曾 艳 孙洪海 王 敏 刘 旭 严丹丹 孙龙飞 刘志超 韦星呈（沈阳医学院，沈阳 110034）

重组激活基因（recombination activating genes，RAGs）编码重组酶RAG1和RAG2，二者通过特异性介导抗原受体V（D）J基因重排，在淋巴细胞分化发育中发挥关键作用［1-2］。V（D）J重排由每个编码基因片段两端的重组信号序列RSS介导，重组激活基因是该过程的主要调控基因［2-5］。RAGs的编码产物RAG-1和RAG-2蛋白的复合物是最重要的重组酶之一，参与V（D）J重组的整个过程并发挥关键作用［6］。分为两个阶段：①重组激活基因RAG-1、RAG-2将DNA切割开［7］；②非同源末端连接装置（NHEJ）将产生的断裂DNA末端连接起来形成重排产物，见图1。

图1 V（D）J重组反应步骤示意图Fig.1 Schematic diagram of V（D）J recombination reaction steps

RAGs基因的突变、重组酶的错误识别和异常表达均可引起严重的临床疾病［8-9］，如：RAG-1或RAG-2发生的错义突变可使其编码的重组酶活性部分丧失，V（D）J重组发生倾向性改变，导致早期淋巴细胞发育被阻断而导致循环中T、B细胞缺失，引起一类严重的联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency disease，SCID），临床上统称为Omenn氏综合征（Omenn syndrome，OS）［10-13］。RAGs基因编码的重组酶催化V（D）J基因重排时，发生的错误识别可导致抗原受体基因和癌基因染色体易位，也是淋巴系统恶性肿瘤发生的重要因素。

近年来，随着分子生物学技术的发展和对遗传性疾病分子机制研究的深入，基因治疗相关研究取得了重大突破［14-15］。在临床应用研究中首先获得成功的是对腺苷酸脱氨酶（adenosine deamlnase，ADA）缺陷所致SCID的治疗［16］。基因治疗以其稳定性、持久性、安全性及适应性而成为极具应用价值的治疗手段。

本研究拟通过恢复RAG-1、RAG-2分子的表达来挽救功能性淋巴细胞的分化、发育，探讨从基因水平上根治RAG-免疫缺陷病的技术方法，为进一步应用基因治疗打下良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源 Jurkat（RAG+人胸腺T细胞）、293T（人胚肾细胞）购于中科院细胞库。

1.1.2 主要试剂 RPMI1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco，美国）；新生牛血清（四季青，中国）；DMSO（Sigma，美国）；Total RNA提取试剂（RNAiso Reagent）、mRNA纯化试剂盒、RTPCR试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒（Agarose Gel DNA Purification Kit）、DNA片段纯化试剂盒、限制性内切酶、感受态大肠杆菌（JM 109）（大连TaKaRa生物工程公司）；Plasmid Midi Kit、转染试剂盒（SuperFect Transfect Reagent）（Qiagen，德国）。

1.1.3 主要仪器 实时荧光定量PCR仪（ABI Prism 7300，美国）；紫外分光光度仪（Spectrometer Lambda 2S，PERKIN ELMER）；荧光和发光检测仪（Turner Biosystems 20/20nLuminometer，美国）；超速离心机（日立CP100WX，日本）；微量高速冷冻离心机（Biofuge 28RS，德国）；PCR扩增仪（Biometra T3thermocycle，英国）；CO2恒温培养箱（SHELLAB TC2323型，美国）；全温振荡培养箱（THZ-C-1，中国）；凝胶成像仪（UVP C-80，美国）；紫外交联仪（SCIENTZ 03-Ⅱ，中国）。

1.2 方法

1.2.1 人类RAG-1、RAG-2表达载体构建 人类RAGs表达细胞株Jurkat（1×107个/ml）在4℃下，以1 500 r/min离心5 min，弃上清。采用RNAiso Reagent提取Total RNA。

采用mRNA分离试剂盒提取mRNA，以此为模板，经RT-PCR扩增全长RAG1、RAG2 cDNA。目的cDNA插入真核细胞表达质粒pcDNA3.1（+），获得携带RAG-1（RAG-2）编码序列的真核表达载体phR1CS（phR2CS）。

1.2.2 细胞培养 选择生长状态良好的人293T细胞，待细胞长至70%连片状态时，用玻璃吸管吸弃培养液。加入0.25%胰酶1 ml（以浸没细胞表面为宜）消化细胞并计数，按5×105个/ml分瓶传代，以10 ml含10%新生牛血清的DMEM完全培养液培养细胞，置于含5%CO2的37℃恒温培养箱中孵育培养。

1.2.3 真核表达载体导入人类293T细胞 接种1×105个/ml细胞孵育24 h，更换新鲜DMEM完全培养基。采用SuperFect Transfect Reagent转染试剂盒将phRAG1 DNA 15µg、DMEM培养基200µl、Super-Fect Transfect Reagent 25µl混合均匀。室温作用20 min后，加入10 ml DMEM完全培养基，立即混匀，加入上述培养细胞。置于含5%CO2的37℃恒温培养箱中孵育40 h，收获转染细胞体。

1.2.4 RAG-1、RAG-2 mRNA表达分析 将0.25%胰酶1 ml加入转染细胞（以浸没细胞表面为宜），37℃孵育，显微镜下观察细胞间连接消失（1～2 min），加入含10%新生牛血清的DMEM培养液5 ml中和胰酶，用吸管轻轻吹打细胞数次，使其分散后，转移至离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清以除去胰酶。以RNAiso Reagent提取Total RNA，分别以hR1CS5-S和hR1CS5-A为正、反向引物，通过RTPCR检测RAG-1 mRNA表达产物；分别以hR2CS5-S和hR2CS5-A为正、反向引物，通过RT-PCR检测RAG-2 mRNA表达产物。以看家基因GAPDH作为内参照。RAG-1、RAG-2 mRNA引物序列见表1。

表1 RAG-1、RAG-2 mRNA表达分析所用引物序列及产物Tab.1 Sequences and products of primers for RAG-1，RAG-2 mRNA expression analysis

1.2.5 DNA测序 选择经限制性内切酶酶切检测后符合目的DNA条件的克隆，以LB液体培养基扩增，Qiagen Plasmid Midi Kit精制质粒后，以T 7 Primer、hR1CS2-S、hR1CS3-S、hR1CS4-S、pcDNA3.1 Reverse Primer为测序引物，委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序部进行DNA测序。测序结果经BLAST软件分析，与GenBank中RAG-1基因（Accession number：NM000448）进行比对，结果完全相同。

RAG-2操作同RAG-1，测序结果经BLAST软件分析，与GenBank中人类RAG-2基因（Accession number：BC022397）进行比对，结果完全相同。DNA测序用引物序列见表2。

表2 DNA测序用引物序列Tab.2 Primer sequences for DNA sequencing

2 结果

2.1 RAG-1基因构建

2.1.1 RAG-1基因的克隆 从表达RAG-1的人类T细胞Total RNA中扩增的RAG-1编码序列大小为3 219 bp（图2）。插入pMD19-T Simple Vector后，获得携带RAG-1编码序列的载体pMD-hR1CS。

图2 RAG-1 RT-PCR扩增产物Fig.2 RT-PCR products of RAG-l

2.1.2 RAG-1真核表达载体的构建及鉴定 以BamHⅠ和XbaⅠ将3 209 bp的目的基因片段从pMD-hR1CS切出后，插入真核细胞表达质粒pcDNA3.1（+），获得携带RAG-1编码序列的真核表达载体phR1CS（图3）。

图3 RAG-1真核表达载体phR1CS结构示意图Fig.3 Diagram of vector phR1CS for RAG-1 expression in eukaryotic cells

重组质粒phR1CS经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切检测进行初步鉴定，得到3 209 bp的目的基因片段及5 366 bp的pcDNA3.1（+）载体片段，同预期的片段大小相符（图4）。阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序部进行DNA测序。测序结果经BLAST软件分析，与GenBank中人类RAG-1基因（Accession number：NM000448）完全相同（附图1，www.immune99.com）。

图4 重组质粒p MD-hR1CS的酶切鉴定Fig.4 Identification of recombinant plasmid p MD-hR1CS by restriction enzyme digestion

2.1.3 人类细胞中外源RAG-1的表达 采用重组质粒phR1CS转染人源细胞株293T后，收获孵育40 h的转染体，提取Total RNA进行RT-PCR检测。结果显示，转染细胞中可检测到782 bp的人类RAG-1 mRNA转录产物，而空质粒pcDNA3.1（+）转染的空白对照未检测到此产物；看家基因GAPDH的RT-PCR检测结果在上述两组间无差异，均获得150 bp的mRNA转录产物（图5）。表明外源人类RAG-1的mRNA已成功表达于293T细胞。

图5 转染重组RAG-1编码序列后RT-PCR检测RAG-1 mRNA在293T细胞中的表达Fig.5 Expression of RAG-1 mRNA in 293T cells was detected by RT-PCR after transfection of recombinant RAG-1 coding sequence

2.2 RAG-2基因构建

2.2.1 RAG-2基因的克隆 从表达RAG-2的人类T细胞Total RNA中扩增的含有RAG-2编码序列的RT-PCR产物为1 628 bp（图6）。插入pMD19-TSimple Vector后，获得携带RAG-2编码序列的载体pMDhR2CS。

图6 RAG-2 RT-PCR扩增产物Fig.6 RT-PCR products of RAG-2

2.2.2 RAG-2真核表达载体的构建及鉴定 用BamHⅠ和XbaⅠ将1 618 bp的目的基因片段从pMD-hR2CS切出后，插入真核细胞表达质粒pc-DNA3.1（+），获得携带RAG-2编码序列的真核表达载体phR2CS（图7）。

图7 RAG-2真核表达载体phR2CS结构示意图Fig.7 Diagram of vector phR2CS for RAG-2 expression in eukaryotic cells

重组质粒phR2CS经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切检测进行初步鉴定，得到1 618 bp的目的基因片段及5 366 bp的pcDNA3.1（+）载体片段，同预期的片段大小相符（图8）。阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序部进行DNA测序。测序结果经BLAST软件分析，与GenBank中人类RAG-2基因（Accession number：BC022397）完全相同（附图2，www.immune99.com）。

图8 重组质粒p MD-hR2CS的酶切鉴定Fig.8 Identification of recombinant plasmid p MD-hR2CS by restriction enzyme digestion

2.2.3 人类细胞中外源RAG2的表达 用重组质粒phR2CS转染人源细胞株293T后，收获孵育40 h的转染体，提取Total RNA进行RT-PCR检测。结果显示，转染细胞中可检测到378 bp的人类RAG-2mRNA转录产物，而空质粒pcDNA3.1（+）转染的空白对照未检测到此产物（图9）。看家基因GAPDH的RT-PCR检测结果在上述两组间无差别，均获得150 bp的mRNA转录产物。表明外源人类RAG-2的mRNA已成功表达于293T细胞。

图9 转染重组RAG-2编码序列后RT-PCR检测RAG-2 mRNA在293T细胞中的表达Fig.9 RT-PCR was used to detect expression of RAG-2 mRNA in 293T cells after transfection of recombinant RAG-2 coding sequence

3 讨论

RAG由一对位置相邻、方向相对排列的RAG-1和RAG-2组成。其编码产物RAG-1和RAG-2蛋白分子相互协同，特异性识别与免疫球蛋白（Ig）基因和T细胞受体（TCR）基因相邻的重组信号序列（recombination signal sequence，RSS）在所募集的其他非特异性DNA酶的共同参与下，进行双股DNA的切口、平端化及再连接，从而完成Ig和TCR的V（D）J基因重排。

获得性免疫防御机制对不同抗原的特异性清除作用依赖与抗原特异性结合的多样性的淋巴细胞组群的生成。淋巴细胞的多样性是通过RAG对Ig基因和TCR基因的重组实现的。

RAG的表达是淋巴细胞及其分化发育阶段特异性的。在执行淋巴细胞生成的中枢免疫器官胸腺和骨髓中，RAG的表达最为活跃。既往研究表明，RAG表达随着淋巴细胞的分化发育形成两次高峰。第一次高峰出现在祖-T（Pro-T）和祖-B（Pro-B）淋巴细胞阶段，此时淋巴细胞正值Ig重链和TCR链基因的重排。第二次高峰出现在前-T（Pre-T）和前-B（Pre-B）淋巴细胞阶段，与Ig轻链和TCR链基因重排有关。随着淋巴细胞分化发育结束，RAG表达终止。RAG表达的阶段性消长与淋巴细胞的分化发育过程密切的相关性亦表明其在功能性淋巴细胞生成中的关键作用。

本研究中，重组质粒phR1CS经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切检测进行初步鉴定，得到3 209 bp的目的基因片段及5 366 bp的pcDNA3.1（+）载体片段，同预期的片段大小相符。对真核表达载体phR1CS进行DNA测序，测序结果经BLAST软件分析与GenBank中人类RAG-1基因（Accession number：NM000448）完全相同；另一方面，重组质粒phR2CS经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切检测初步鉴定，得到1 618 bp的目的基因片段及5 366 bp的pcDNA3.1（+）载体片段，同预期的片段大小相符。对真核表达载体phR2CS进行DNA测序。测序结果经BLAST软件分析，与GenBank中人类RAG-2基因（Accession number：NM000536）完全相同。

本实验采用RT-PCR方法成功克隆了人类RAG-1编码基因和人类RAG-2编码基因，构建出RAG-1、RAG-2真核表达载体，并在转染的人类细胞293T中获得外源RAG-1、RAG-2的mRNA表达。为进一步探讨有效、足量表达功能性RAGs分子的技术手段，从基因水平上根治RAGs免疫缺陷病奠定了基础，其基因转移操作不需要复杂设备和技术，便于应用，非常适合临床治疗的迫切需要，RAG1、RAG-2蛋白的表达功能活性将于后续报告阐述。