腹腔感染致脓毒症实验动物模型建立方法的研究进展

2022-11-25何振华李永成朱高勇

当代医药论丛 2022年12期

何振华，李永成，朱高勇

（贺州市人民医院，广西贺州 542800）

脓毒症是人体对感染反应失调所导致的一种全身炎症反应综合征。此病可引发全身炎症反应，是导致人类死亡的重要疾病之一[1]。在临床ICU，腹腔感染所致脓毒症的发生率较高，达到40% 左右，其致死率约为36%[2-3]。近年来随着我国医疗技术的提高，临床上对于脓毒症的治疗取得了一定进展，但其发病率和致死率仍较高[4]。腹腔感染是腹部外科的常见病，多继发于消化道穿孔、阑尾炎、肠梗阻、肠坏死等腹部疾病或腹部手术后并发症（如胃肠道瘘）[5]。腹腔感染若处理不及时，易发展为脓毒症。脓毒症发病十分迅速，且病情凶险，临床治疗的难度较大，患者的预后差。人类脓毒症的发病过程首先是急性促炎因子的爆发，然后是代偿性抗炎阶段，最后是免疫抑制阶段[6-7]。脓毒症动物模型的建立有利于本病的研究，能够为脓毒症发生机制的研究提供新思路。但实际上，由于脓毒症动物模型存在引发剂性质不同、疾病发展时间不同、脓毒症发展过程中有无合并症及缺乏在人类脓毒症治疗中常用的支持治疗（如液体复苏、使用血管活性药物、呼吸机等）等问题，导致脓毒症动物模型受到部分研究者的质疑[8]。未来脓毒症动物模型的研究可集中在减少这些变异因素方面，以便更接近人类脓毒症模型。腹腔感染模型是目前最常采用的脓毒症动物模型，近年来受到许多研究者的关注。本文主要是对腹腔感染致脓毒症实验动物模型建立方法的研究进展进行综述。

1 脓毒症实验动物模型的选择

实验动物模型的应用克服了在人身上研究的限制，避免了对人体进行临床试验所带来的风险及伦理学问题。通常来说，临床上的脓毒症是十分复杂的，许多脓毒症患者本身就伴有其他严重的非相关性疾病（如心脏病、呼吸系统疾病等），这会对脓毒症的发生发展产生较大的影响，往往难以判断患者的发病时间及具体病情[9]。应用脓毒症动物模型则排除了临床研究过程中其他因素的干扰，且可以从性别、年龄、体重、遗传等方面控制实验动物，能更客观地反应脓毒症的发病过程[10]。当前可用于建立脓毒症模型的动物品种较多，各类动物又有其不同的特点，可用于不同目的的研究[11]。到目前为止，小型哺乳动物如大鼠、小鼠仍然是最好的动物模型，应用最为广泛，原因是可以建立大量性别、年龄相同、遗传相似度高的实验模型，且其价格低，易于管理。Sato[12]等利用特定基因敲除小鼠研究其在脓毒症期间发生的免疫功能变化，从而对脓毒症的发生机制进行了研究。在选择脓毒症动物模型时，需结合其年龄、性别、品系等因素。Zellweger 等[13]首次报道不同性别脓毒症小鼠模型的差异，他们建模后发现雄性小鼠的10 d 存活率低于雌性小鼠，其脾细胞增殖能力及白细胞介素-2（interleukin，IL-2）、IL-3 的释放量明显降低，但与雌性脓毒症小鼠无明显差异。有研究报道，与年轻脓毒症小鼠相比，老龄脓毒症小鼠的死亡率更高，且建模后24 h 其血IL-6 和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factoralpha，TNF-α）的水平均较高，对抗生素治疗更为敏感[14]。宋景春等[15]选用BALB/c 小鼠和昆明（KM）小鼠建立脓毒症模型进行研究，发现BALB/c 小鼠对脓毒症盲肠结扎模型的敏感度更高，说明不同品系的动物能够对脓毒症模型造成影响。因此，研究者可结合自己的研究目的，选择适宜的实验动物。

2 常用腹腔感染致脓毒症动物模型的建立方法

目前，腹腔感染致脓毒症动物模型的建立方法有注射法和外科手术法，其中注射法包括腹腔注射内毒素、细菌或粪便颗粒等，而通过外科手术建立的腹腔感染致脓毒症动物模型则多为盲肠结扎穿孔模型（cecal Ligation and Puncture，CLP）和腹腔持续置管引流模型（colon Ascendens Stent Peritonitis，CASP）。

2.1 注射法

2.1.1 内毒素注射模型内毒素广泛存在于革兰阴性菌细胞壁的外膜中，属于一种脂多糖成分，其广泛用于临床研究中，如通过内毒素血症模型研究炎症相关机制和细胞因子谱。相关的研究指出，通过给志愿者注射少量的内毒素，可引起较多的轻微症状，如体温升高、头痛等，但以上症状在数小时后均可消退[16]。在人体实验中，内毒素所致败血症的特点是通过增加循环血浆中宿主炎性反应介质（如TNF-α、IL-6、IL-10 等）的浓度，使炎性细胞因子的表达逐渐及长期升高[17]。通过腹腔注射内毒素能引起小鼠脓毒症样症状，将类似于某些爆发的人类革兰阴性菌感染的病理生理变化充分表现出来，而大剂量注射内毒素通常会引起促炎细胞因子急性且短暂的升高[18]。有研究报道，内毒素可损害心肌的收缩能力，并增加循环中TNF-α、IL-6 的浓度[19]。与人类相比，小鼠对脂多糖毒性或致死效应的敏感性要低得多，因此，它们需要更高剂量的脂多糖来显示这种效应。由此可见，脂多糖诱导的脓毒症小鼠模型不能准确反映人类脓毒症的特点，有一定的局限性。

2.1.2 特定的细菌接种模型特定的细菌接种模型是指将已知数量的细菌及辅助物质混合接种于腹腔内所建立的腹腔感染致脓毒症动物模型[20]。此类动物模型的死亡率取决于注射细菌的数量及所使用的液体和抗生素[7]。虽然此类动物模型是可控、可复制的，但如果注射剂量掌握不好，就会导致细菌不会在宿主体内定植，也不能繁殖，反而会立即被机体的补体系统裂解，使其被包裹，进而形成局部脓肿，难以引起腹腔感染及脓毒症[19]。故细菌接种模型的应用受到一定限制。

2.1.3 粪便颗粒模型粪便颗粒模型一般是指通过向动物的腹腔内注射含有粪便及辅助物颗粒所建立的腹腔感染致脓毒症动物模型。建立此类动物模型的操作较为简单，但首先需要初步制备样品，并对其细菌的组成进行标准化[21]。与经典的脓毒症动物模型不同的是，通过向腹腔注射粪便颗粒建立的脓毒症动物模型可能会出现强烈的免疫反应，导致其早期死亡，难以再现脓毒症的血流动力学和代谢的改变[22]。此类动物模型脓毒症的动态变化是通过改变粪便颗粒内容物的量来调控的，由于某些细菌在样品制备过程中死亡，因此可在一定程度上影响实验效果。此外，粪便颗粒提供了腹膜炎后腹腔脓肿的模型，而不是腹腔败血症模型。因此，该模型是难以控制和复制的，现已逐渐被其他模型所取代。

2.2 外科手术法

2.2.1 盲肠结扎穿孔（CLP）模型建立CLP 模型的操作方法较多，经典方法是[23]：首先对大鼠进行麻醉，在无菌条件下用手术刀在其腹壁作一长约2 cm 的切口，经切口进入腹腔，寻找盲肠，采用无菌丝线将盲肠的远端结扎，并选择相应的无菌针头在已经结扎的盲肠端进行贯通穿刺，将少量的盲肠内容物挤出，以保证穿刺孔的通畅。之后将盲肠推回腹腔内，将腹腔关闭，最后进行逐层缝合操作。CLP 模型的建立主要是通过外科手术的方式，将一定量含有混合细菌的粪便漏入腹腔内，且腹腔内存在失活组织（结扎的盲肠），从而导致腹腔感染并引起腹膜炎，出现脓毒症的临床症状（如发热、食欲不振、嗜睡等），最后导致实验动物因脓毒症休克而死亡，其病理生理变化过程与临床情况十分接近，且能对临床上的阑尾炎或憩室炎穿孔的特点进行模拟。有学者通过对内毒素攻击模型和CLP 模型的病理生理反应进行比较，发现二者在细胞因子反应的数量上存在明显差异，从而可充分反映高代谢和晚期低动力循环的血流动力学变化过程及临床脓毒症患者的早期高动力循环情况[24]。近年来，许多学者利用CLP模型进行抗感染、代谢、凋亡、细胞因子和免疫功能等方面的研究，均取得了一定成效[25]。CLP模型具有诸多优势，如易于标准、操作简单，且具有较好的可重复性，能够将不同的变量因素引入，包括动物的性别、年龄、种类、盲肠结扎长度、穿刺孔数目、穿刺孔大小、术后液体复苏及抗生素的应用等[26]。在决定模型死亡率和炎症反应程度的重要因素中，盲肠结扎长度、穿刺孔大小及数目所占的比例较高。但该模型也有一定的缺点，如在建立模型后，难以估计流入腹腔内肠内容物的量，有时肠内容物会被包裹，表现为局限性炎症，难以发展为脓毒症。因此，今后还需通过更深入的研究来改进和完善CLP 模型，使之更加标准化。

2.2.2 腹腔持续置管引流（CASP）模型 Traeger等[27]报道，CASP 模型的建立方法较多，其中经典方法是：首先按照建立CLP 模型的方法将大鼠的腹腔打开，寻找盲肠，将用静脉输液BD 针制作的支架固定在距离回盲部1 ～1.5 cm 处的升结肠壁，使肠腔与腹腔相通，并采用棉签进行轻轻按压，从而保证肠内容物能够从置管中溢出。完成上述操作后，将适量的生理盐水置入腹腔内，最后关闭腹腔，逐层缝合伤口。与CLP 模型相比，CASP 模型是一种新型的脓毒症动物模型，其建模原理是：通过在升结肠壁置入用静脉输液BD针制作的支架，使肠腔与腹腔相通，导致肠内容物持续渗漏至腹腔内，从而引起腹腔感染，随着病程的不断进展，最终可发展为脓毒症和多器官衰竭。上述病理变化与肠瘘的病理变化十分相似。研究发现，建模成功后，CASP 模型炎性细胞因子的水平会逐渐升高。以往的研究表明，CASP 模型中不同管径的支架与动物血清细胞因子水平的变化、生存率之间存在密切的相关性，即支架的管径越大，动物的生存率越低，其变化幅度与CLP模型相比更加显著[28-29]。用小支架建立的CASP模型适合长期研究和轻- 中度脓毒症的研究[30]。由此可见，通过对置入支架管径的大小进行改变，可对脓毒症动物模型的炎症程度进行控制。有学者通过对小鼠的体温进行研究，将CASP 小鼠模型分为两组，即轻症组（体温＜32℃）和重症组（体温≥32℃），结果发现，两组小鼠在血清细胞因子、外周血白细胞计数、生存率等方面存在明显的差异性，提示通过监测体温能够对脓毒症动物模型的严重程度进行早期预测[31]。有研究发现，CASP 大鼠模型在手术18 h 后其肝、肾、肺和心脏的代谢组学及病理生理变化均较大，说明建模后时间点的选择对判断脓毒症很重要[32]。与CLP模型相比，CASP 模型的炎性细胞因子水平会持续升高，原因是随着时间的推移，CASP 模型的肠内容物会持续渗漏。而在CLP 模型中，由于早期肠粘连的形成，病灶被包裹，炎症较为局限。CASP模型的缺点是建模相对复杂，存在差异性，另外粪便内的细菌会持续进入动物的腹腔，无法控制。对于CLP 模型而言，其研究的重点是局限性腹腔脓肿形成的病理变化；对于CASP 模型而言，其主要用于研究弥漫性腹膜炎的临床病程。