4-乙酰胞苷的形成、功能及其与疾病的关联性研究进展

唐竞桐 综述陈悦 审校

遵义医药高等专科学校，贵州 遵义 563006

真核生物及原核生物的核苷酸上均存在多种转录后修饰类型。一些存在于tRNAs及rRNAs上的核苷酸修饰同样存在于mRNAs上[1-2]，包括7-甲基腺苷(methylguanosine，m7G)、6-甲 基 腺 苷(N6-methyladenosine，m6A)、5-甲基胞苷(5-formylcytidine，f5C)、4-乙酰胞苷(N4-acetylcytidine，ac4C)、甲基化胞嘧啶(methylated cytosine，Cm)、甲基化鸟嘌呤(methylated guanine，Gm)、甲 基 化 腺 嘌 呤(methylated adenine，Am)、5-甲基胞苷(5-methylcytidine，m5C)及假尿嘧啶(pseudouridine，ψ)修饰等[3-4]。作为第一种发现的核苷酸乙酰化修饰，ac4C是除m7G、m6A及f5C外同样在mRNAs[5]上存在的另一种广泛化学修饰类型[2]。

tRNA、rRNA和mRNA上的ac4C均由N-乙酰转移酶10(N-acetyltransferase 10，NAT10)及其在不同物种上的同源酶所催化[5]。NAT10催化ac4C的形成需要乙酰辅酶A(acetyl-coenzyme A，CoA)提供乙酰基，ATP水解提供能量[6]。在tRNA的ac4C过程中，NAT10还需要含有THUMP结构域1(THUMP domain containing 1，THUMPD1)蛋白的辅助实现与tRNA的结合[7]。在rRNA的ac4C修饰中，NAT10需要小核仁RNA(snoRNA)的反义序列辅助与靶序列相结合[7-8]。研究发现，ac4C的存在有助于增加tRNA蛋白质翻译的高保真[9-10]，并起到维持生物体耐热性的作用[11-12]。在rRNA上ac4C的存在被发现是嗜热微生物的重要特征[12]，对于维持蛋白质翻译的准确性也很重要[7]。而在mRNA上，目前的研究表明ac4C对于维持其稳定性及蛋白翻译效率功能具有重要作用[5，13]。

在疾病条件下，ac4C的含量在人的体液中发生显著改变。例如，与正常人群相比，在某些疾病患者的尿液中发现ac4C显著上调，包括妊娠期糖尿病[14]、间质性膀胱炎(interstitial cystitis，IC)[15]、获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)[16]、泌尿生殖道肿瘤[17]、上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)[18]及乳腺癌等疾病[19]，提示ac4C很可能在疾病的发病及进展中发挥关键功能。本文总结了ac4C的研究历史及其在调控基因表达及在人类多种疾病特别是在癌症中的功能及机制，随后展望了ac4C研究未来可能面临的挑战及相关核苷修饰对mRNAs相互作用的研究策略。

1 RNA乙酰化修饰的分类及ac4C

RNA乙酰化存在3种核苷酸修饰类型。其中，N6-乙酰腺苷(N6-acetyladenosine，ac6A)[20]及N4-乙酰-二氧甲基胞苷(N4-acetyl-20-O-methylcytidine，ac4Cm)[21]这两种修饰类型偏好于嗜热的古生菌上。与之不同，ac4C无论是在真核生物还是原核生物中均表现为一种更加保守的核酸化学修饰类型。ac4C的化学分子式为C11H15N3O6。通过三维X线衍射仪的方法，tRNA上发生核苷修饰ac4C的晶体结构证实，其N4位被乙酰基取代的位置靠近tRNA的C端(即5’末)[22]。

2 不同种类RNAs上的ac4C

2.1 tRNA上的ac4C 1966年，ac4C在线 虫的tRNA上被首次报道[23]。1972年，大肠杆菌(E.coli)延伸体蛋氨酸tRNA(methionine tRNA，tRNAMet)摆动位置处的ac4C修饰被发现[24]。随后，ac4C被证实能够通过稳定核糖C3’末端构象的方式来辅助tRNA正确地阅读密码子[9，25]。ac4C修饰同样在线虫的亮氨酸tRNA(leucine tRNA，tRNALeu)上第12号位置[26]和在啤酒酵母的线虫丝氨酸tRNA(serine tRNAs，tRNASer)上被陆续发现[27-28]。近期研究表明，在真核生物的tRNA上，ac4C仅能发生在其第12号位置上[27，29]。2004年，JOHANSSON等[30]发现了ac4C可在酿酒酵母中起到稳定丝氨酸tRNA(tRNASer)的作用。

2.2 rRNA上的ac4C ac4C不仅能够发生在tRNA上，在rRNA上也同样发现了ac4C的存在。1978年，THOMAS等[31]发现ac4C可存在于大鼠18S rRNA的小亚基上，该研究首次表明了ac4C在真核生物18S rRNA上的存在。随后，JOHANSEN等[32]在网柄菌18S rRNA的3’末端螺旋上也发现了ac4C修饰的存在。1993年，ΒRUENGER等[12]发现了四膜虫5S rRNA上存在ac4C。在人的HEK293T细胞中，NAT10催 化18S rRNA第1 842位 置 上ac4C的 形 成[33]。SHARMA等[7]研究表明，在萌发的裂殖酵母和人HCT116细胞系的18S rRNA上发现了两个ac4C修饰位点：一个在螺旋34处，该位点对于翻译的准确性至关重要，而另一个则在螺旋45处，该位置位于解码位点附近。

2.3 mRNA上的ac4C既往关于ac4C的发现主要集中于tRNA和rRNA上。近年来，研究发现大量的ac4C修饰同样在人类及线虫的mRNAs上被检测到[2，5]。2018年，ARANGO等[5]首次报道了人类转录本上4 000多个区域上存在ac4C修饰。在人的Hela细胞中，ac4C被发现主要富集在编码区(coding sequence，CDS)，且从转录本5’端至3’端，ac4C的含量逐渐降低[5]。2019年，TARDU等[2]亦报道了ac4C的含量在线虫mRNA样本中同样具有较高的丰度，且ac4C修饰在氧化应激条件下可发生显著上调。

3 调节ac4C的相关酶

2000 年，KUΒOKI等[34]从黑曲霉脂肪酶水解的过乙酰胞苷中提取了ac4C，这是一种与ac4C合成有关的高效酶。随后发现酿酒酵母假定的tRNA乙酰转移酶(Tan1)在tRNALeu和tRNASerac4C形成中发挥重要作用[30]。此外，OASHI等[24]发现大肠杆菌延伸器tRNAMet上摆动碱基位置的ac4C可防止AUA密码子的误读，以确保能够准确识别AUG密码子。进一步研究发现，在乙酰辅酶A和tRNAMet存在的情况下，tRNAMet胞苷乙酰转移酶(tRNAMet cytidine acetyltransferase，TmcA)可刺激ATP/GTP水解，进而催化细菌tRNAMet的摆动碱基处形成ac4C[6]。

NAT10是组蛋白乙酰转移酶GCN5相关NAT(GCN5-related NAT，GNAT)家族的一员[35]。NAT10在其他物种中的同源基因包括DROME(黑腹果蝇)、SCHPO(粟酒裂殖酵母)、ARATH(拟南芥)、CAEEL(线虫)[35]和Kre33(酿酒裂殖酵母)。NAT10是一种催化rRNA、tRNA和mRNA上ac4C形成的乙酰化酶。其中，催化tRNA和rRNA的ac4C分别需要辅因子THUMPD1和snoRNA的辅助。目前尚未发现催化mRNA形成ac4C过程中需要的辅因子。ITO等[33]发现Kre33是目前唯一同时具有乙酰化酶结构域和RNA结合结构域的蛋白，因此其被认为是RNA的ac4C修饰酶。Kre33(NAT10的同源基因)催化酿酒酵母18S rRNA的1773位形成ac4C[36]。与NAT10相似，Kre33还催化1842位酿酒酵母18S rRNA(39)和线虫12位酵母tRNALeu和tRNASer的ac4C形成[37]。此外，Kre33还需要Tan1基因在酿酒酵母tRNA在乙酰化过程中与tRNA结合，这与人类NAT10和THUMPD1之间的协作过程类似[7，37]。Tan1和THUMPD1都有一个tRNA结合域，在热自养嗜热细菌中，MTH_RS04295(Tan1基因的同源基因)对于tRNA上ac4C的催化合成至关重要[35]。

ARANGO等[5]证明了人HeLa细胞mRNA中ac4C的存在，发现NAT10敲除的细胞系中mRNA中ac4C修饰水平发生明显下降。在酵母中，ac4C的形成也与前体mRNA保留和剪接复合体(retention and splicing complex，RES)有关。研究发现，RES复合物高度保守，在 酵 母 中 由Βud13p、Snu17p和Pml1p组 成。Βud13p或Snu17p的缺失将导致tRNA中ac4C的显著降低，而Pml1p的缺乏显著降低了高温条件下的ac4C水平。RES通过控制Tan1的前体mRNA的剪接效率影响Tan1的翻译，进而调控tRNA上ac4C的形成[38]。TARDU等[2]发现，如果将酵母暴露于氧化应激条件下，其mRNA上可出现了大量的ac4C，而在Rra1(NAT10同系物)敲除后，即使在H2O2诱导下，酵母mRNA上几乎检测不到ac4C的发生；同时，高氧化应激条件下酵母mRNA中ac4C含量被发现显著增加，提示ac4C很可能在氧化应激反应中发挥关键作用。

4 ac4C参与蛋白质的翻译过程

4.1 ac4C帮助维持翻译的保真性研究发现，发生在大肠杆菌tRNAMMet反密码子环中“摆动”位置(第34位)的ac4C可以帮助tRNA准确读取非起始AUG密码子[24]。tRNAMMet摆动位置的ac4C降低了tRNA对密码子AUG的亲和力，从而减少了蛋白质合成过程中密码子的翻译作用[25]。同时，摆动碱基位置的ac4C可稳定核糖的C3’末端构象，从而促进了与CG碱基对的相互作用，保证了AUG密码子正确解码为蛋氨酸[9]。同时，KUMΒHAR等[10]发现ac4C的N4-乙酰基侧链的远端构象可能是避免蛋白质翻译过程中异亮氨酸AUA密码子错误解码的重要原因。

4.2 ac4C提高翻译效率及稳定性近年来，ARANGO等[5]采用全转录组测序的方法研究了ac4C在人mRNA中的定位及其功能。该研究结果发现，ac4C主要富集在mRNA的CDS区，且发生ac4C修饰的mRNA拥有更长的半衰期。进一步发现含ac4C的mRNA主要富集到一个摆动位点C的密码子上。荧光素酶报告基因检测表明，摆动位点C密码子的ac4C修饰显著促进了蛋白质翻译效率。该研究假设，ac4C或可通过增强碱基相关鸟苷的热稳定性来增强翻译效率，影响mRNA翻译过程中与同源tRNA的相互作用。

4.3 ac4C维持tRNA的稳定性和细胞的高耐热性研究发现，Tan1基因缺失的酿酒酵母突变体中ac4C和tRNASerCGA水平降低，提示ac4C和Tan1在维持成熟tRNASerCGA的稳定性中发挥重要作用[30]。XU等[39]证实酵母Tan1基因上催化位点的失活导致tRNA中ac4C的降低和tRNASerCGA丰度的下降。ΒRUENGER等[12]发现ac4C和ac4Cm存在于2株耐热菌株(嗜热嗜血杆菌和牛磺酸)5S rRNA的相同序列中，提示ac4C可能与高耐热性有关。KAWAI等[21]分析了ac4Cm在极端嗜热tRNA上的构象特征，发现胞嘧啶的2’-氧-甲基化及ac4C可稳定tRNA的C3末内构象，导致极端嗜热tRNA的产生。2019年，ORITA等[11]通过人工转座子技术将突变随机插入到嗜热古细菌中，发现一些核苷修饰从tRNA上的消失会导致耐热性差的突变体产生。然而，他们并没有进一步观察到缺乏ac4C的tRNA的发生熔点的显著下降。上述证据均表明ac4C在维持tRNA的稳定性中起重要作用，且与细胞的高耐热性有关。

5 ac4C与多种疾病的发生发展

5.1 ac4C与炎症反应DOSKOCIL等[40]发现包括ac4C在内的一些发生修饰的核苷类型，可促进焦土霉素对大肠杆菌的抗菌作用。据推测，这些核苷类似物可能通过竞争细胞表面细菌遗传活性的核苷结合位点，进而抑制细菌增殖引发的炎症。研究发现，尿液中ac4C水平升高也可能与炎症反应有关。PARSONS等[15]分析了62例IC患者和33例对照者的尿液样本，发现IC患者尿液ac4C的含量增加了24%。该研究还发现，高尿调蛋白水平与ac4C和其他代谢物水平降低相关。新近研究表明，尿调蛋白还可通过核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)家族(包含NLRP3等)触发白细胞介素-1β(IL-1β)依赖性天然免疫[41]。炎症反应中ac4C的含量也可在血浆中发生减少。LAGUNA等[42]分析了25例肺纤维化患者血浆样本中的代谢情况，他们发现肺纤维化患者血浆中的5种核苷，如ac4C的水平明显低于标准水平。此外，DUAN等[43]还发现ac4C可以兴奋神经胶质，诱导高迁移率族蛋白Β1(HMGΒ1)信号维持NLRP3神经源性炎症反应。上述证据表明，ac4C可能广泛参与炎症相关的人类疾病。

5.2 ac4C与代谢性疾病FURMAN等[44]发现大鼠ac4C和腺嘌呤水平升高与大鼠高血压相关。ac4C和腺嘌呤联合应用促进NLR家族Caspase募集结构域蛋白4(NLR family caspase recruitment domain-containing protein 4，NLRC4)基因的表达，激活NLRC4炎性小体，增加IL-1β的产生，进一步激活血小板和白细胞，从而升高血压。他们推测，老年人群氧化应激的增强是由于加速了tRNA的分解，增加了ac4C修饰水平。研究表明，ac4C与妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)相关。LAW等[14]分析了27例中国GDM患者和34例正常孕妇的尿液样本，发现GMD患者尿液中的一些甲基化或修饰碱基(包括ac4C)显著增加。为了探讨尿毒症与人核苷代谢的关系，NIWA等[45]比较了多组血清和尿液样本中核苷代谢物水平的差异，包括10例健康人群(5例男性和5例女性)、11例未透析慢性肾功能衰竭(chronic renal failure，CRF)患者(6例男性和5例女性)、17例血液透析(hemodialysis，HD)尿毒症患者(9例男性和8例女性)和14例持续性非卧床腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis，CAPD)尿毒症患者(5例男性和9例女性)、他们发现，与正常人相比，所有尿毒症患者(尤其是CAPD患者)的ac4C的水平均显著升高；此外，与正常对照相比，CAPD患者血清中ac4C水平升高幅度显著大于HD患者，而未透析的慢性CRF患者尿液中ac4C含量明显下降，说明尿毒症患者RNA代谢发生改变，并导致包括如ac4C修饰在内的核苷异常积累[45]。

5.3 ac4C与自身免疫性疾病为探索进展性复发-缓解型多发性硬化(progressive relapsing-remitting multiple sclerosis，PRMS)与核苷代谢产物的关系，ΒHARGAVA等[46]分析了18例健康个体和18例患者血浆中的代谢物，研究发现，与健康受试者相比，代谢物ac4C在多发性硬化症患者中显著升高。尿液中核苷代谢水平与艾滋病存在关联。ΒOREK等[16]比较了多组血清和尿液样本中核苷代谢物水平的差异，包括14例患有AIDS症状的患者、21例诊断为AIDS的同性恋患者和52例未受累的双性恋人群(18～60岁)。该研究结果显示，在感染人类T细胞白血病-淋巴瘤病毒3型(human T cell leukemia-lymphoma virus 3，HTLV-3)和诊断艾滋病的患者尿液中，ac4C的水平显著升高。这提示ac4C或可用于鉴定对AIDS的易感性。

5.4 ac4C与癌症大量研究表明，ac4C在癌症的诊断和治疗中具有重要意义。THOMALE等[47]通过给小鼠注射单剂量致癌物3-甲基胆嘌呤后测定小鼠尿液中12种修饰核苷的排泄率。他们发现，晚期肿瘤小鼠排泄的核苷水平是正常小鼠的数倍。在肿瘤诊断前，其中的核酸组分(如ac4C)的排泄率显著增加，而对照小鼠和接受致癌物注射但无肿瘤形成的小鼠的排泄值均无显著变化。LIEΒICH等[48]发现癌症患者尿液中的核苷明显升高，其中，ac4C升高较普通核苷明显，揭示出ac4C可能是诊断肿瘤的有效指标。SZYMANSKA等[17]检查了160例泌尿生殖系统癌症(urogenital cancer，UC)疾病患者和96例健康人的尿液样本，他们发现，泌尿生殖系统癌症患者尿核苷代谢物水平升高(ac4C增加25%)，这些尿苷可应用于UC的诊断。ZHANG等[18]对患者多组尿液标本进行代谢分析，其中术前EOC患者40例，术后上皮性卵巢癌患者18例，卵巢良性肿瘤患者62例，健康人53例。他们发现，术前卵巢上皮癌患者尿液中有22种代谢物标志物(包括ac4C)显著增加，而且，18例接受手术的上皮性卵巢癌患者在手术7 d后尿液样本中ac4C水平明显下降，其中4例几乎恢复到正常水平。LI等[19]发现17例ΒC患者尿液中4种代谢修饰因子水平明显高于正常对照组的19种，他们还指出，通过ac4C用于诊断乳腺癌的受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)下曲线面积为0.825，提示ac4C可成为乳腺癌的潜在生物标志物。

6 展望

ac4C已在各种原核和真核生物的tRNA、rRNA上被检测到。与之相比，有关mRNA的ac4C研究相对较少，未来需要通过更多的研究来探索有关mRNA上的ac4C修饰。当前研究表明，ac4C的形成与不同物种中NAT10及其同系物有关[2，5]。NAT10需要THUMPD1蛋白参与tRNA的ac4C形成，需要snoRNA的辅助情况下催化18S rRNA ac4C的形成[7-8]。然而，目前尚不清楚在mRNA中ac4C的形成中是否存在NAT10的其他辅因子。同时，亦不清楚ac4C在各种RNA中是否存在去乙酰化机制。

在人HeLa细胞中敲除NAT10后，mRNA中ac4C含量显著降低，但mRNA上仍能检测到约20%的ac4C修饰残留[5]。而在Rra1敲除的酵母中，ac4C几乎完全消失[2]。造成该结果的原因可能为HeLa细胞NAT10敲低并不完全，或提示在人mRNA中还存在参与ac4C形成的其他替代过程。另外，在mRNA上目前发现至少有15种核苷酸修饰的存在。其中，m6A和1-甲基腺苷(N1-methyladenosine，m1A)功能与ac4C相似，它们均可参与mRNA的翻译过程，调节翻译效率和mRNA的稳定性[4-5，49-51]。然而，目前尚不清楚ac4C是否或如何与其他核苷修饰类型发生相互作用[5]。

ac4C参与基因表达调控过程，如基因翻译、密码子的配对识别。目前，ac4C被发现存在于tRNAMet的摆动和tRNASer的D臂tRNALeu上[5，28]。在人HeLa细胞mRNA中，ac4C峰似乎富集在编码氨基酸的第三个密码子中，从而提高其翻译的效率和准确性[5，13]。然而，目前还没有核苷分辨率图谱证据支持这种富集，ac4C在第一和第二密码子中的作用仍不明确[5]。在人类和酵母中，ac4C主要存在于具有poly-A尾的mRNA的CDS区域[2，5]。除CDS和UTRs处存在ac4C外，内含子区也存在ac4C，但内含子区的ac4C不受NAT10活性丧失的影响[5]。此外，尚不清楚mRNA和无poly-A尾的长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是否存在ac4C修饰。其他高度稳定的RNA，如环状RNA和微小RNA(micro RNA，miRNA)中ac4C修饰的存在，未来也需要进一步的深入研究。

ac4C作为人类mRNA上的修饰类型之一，与许多人类疾病密切相关。但当前关于人类ac4C在mRNA中的发现是基于人的HeLa细胞来源。相关研究需要在更多的物种和其他细胞类型中去进一步阐述。另外，在真核生物中，ac4C修饰绝大多数被发现存在于mRNA上，且ac4C含量在氧化应激条件下发生显著增加[2]。未来，需要进一步研究证实在患者尿液中ac4C含量的增加是否由于氧化应激所引起。另外，针对ac4C在疾病的诊断和治疗中的特异性和敏感性需要进一步的大规模临床研究来证实。相信随着检测方法的改进，ac4C对疾病的诊治和预后的价值将得到更好的阐明，为人类相关疾病的预防和治疗提供新的思路。