真菌荧光染色法检测健康皮肤和炎症性皮损的真菌定植

朱静娜 莫慧慧 梁燕华

南方医科大学深圳医院皮肤美容与性病科, 深圳，518101

人体皮肤作为一个独特多变的生态系统，寄生在上面的微生物群落复杂丰富，其成员总数至少是人体自身细胞数量的十倍[1]。微生物群落的变化，可以改变宿主与微生物的相互作用，并与皮肤病的发生有关[2]，正常微生物群落的能力降低可使慢性疾病成为永久性疾病[3]。从婴儿期过渡到成年期，皮肤会产生一系列的生理变化，微生物群落也随之发生重大变化。青春期，微生物区系以亲脂性为主，这反映了性成熟和激素刺激的皮脂腺活性的增加[4]。另外，男性和女性的皮肤在激素代谢、皮脂合成、皮表酸碱度(pH值)、脂肪堆积、血清瘦素等方面存在着差异[5]，可导致微生物的菌群差异，进一步对皮肤病的发生发展产生影响。有研究表明，银屑病、湿疹、玫瑰糠疹(PR)、特应性皮炎(AD)等炎症性皮病与真菌定植数量和真菌定植率有关。

微生物和宿主之间的动态平衡失调与皮肤病的发生有关，真菌在其中扮演的角色亦不可忽略。念珠菌、马拉色菌、酿酒酵母菌等皮肤常驻菌能影响皮肤屏障、调节皮肤免疫平衡和介导炎症反应，在AD发病中起重要作用[6]。本研究利用真菌荧光染色法鉴定健康皮肤不同体表部位的真菌阳性率和定植量，并检测炎症性皮肤病不同部位皮损处的真菌定植率和孢子数量，探讨真菌感染与炎症性皮肤病之间的关系，将为不同部位真菌感染的临床治愈停药指征提供实验室参考。

1 研究对象与研究方法

1.1 研究对象 从2019年1～12月，南方医科大学深圳医院皮肤美容与性病科共收集1345例皮屑样本，其中健康人888名[男388名，女500名；年龄0～70岁，平均(34±12)岁]和457例炎症性皮肤病患者(男241例和女216例)。其中，银屑病40例[男22例，女18例；年龄17～75岁，平均(38±14)岁]，AD患者37例[男19例，女18例；年龄0～59岁，平均(11±15)岁]，湿疹337例[男179例，女158例；年龄0～80岁，平均(35±18)岁]；PR患者43例[男21例，女22例；年龄1～59岁，平均(30±14)岁]。见表1。

1.2 研究方法

1.2.1 采集部位 头皮、颈后、胸背部、面部、上肢、腹股沟、腘窝、肘窝、足底9个部位采集皮屑标本。根据皮肤的生理特征，可分为三个部位：皮脂溢出部位、干燥部位和潮湿部位[7]。本研究中皮脂溢出部位指面部、颈后、上胸部和背部；干燥部位指双上肢；潮湿部位指腹股沟、腘窝、肘窝。其中，由于头皮取材方法(刀片刮取法)与其他部位取材方法(胶带黏取法)不一样，头皮从皮脂溢出部位分离出来单独比较；由于足部真菌菌落结构的多样性和不稳定性，足底作为一个单独的研究部位[7,8]。炎性皮肤病组中标本采集部位均为皮损区。

1.2.2 纳入和排除标准 所有受试者均征得其同意[2018JD175]。皮肤病的诊断符合银屑病、AD、湿疹、PR的临床诊断标准。所有受试者在 12～24小时内避免洗澡，7天内避免使用润肤剂、抗生素或抗真菌肥皂。

1.2.3 取材方法 用宽2.5 cm的透明胶带(中国浙江得力集团有限公司)以相同的强度黏贴皮肤，重复3次，每次3 s；由于头皮存在毛发覆盖， 利用无菌手术刀片(上海浦东金环医疗用品股份有限公司)从3个相邻的部位刮取头皮屑，每个部位刮20次。将采集到的标本置于载玻片上(中国，SAIL BRAND)，加入1滴荧光染色剂(南京汉瑞生物科技有限公司)，轻轻按压盖玻片(江苏世泰实验器材有限公司)，静置约30 s，使样品与染色液充分混合，然后放置于荧光显微镜下观察(奥林帕斯，型号BX43F)，随机选择30个视野(40×)计数，在统计表上记录并统计孢子数量。

1.2.4 统计学方法 统计学方法使用秩和检验(分析软件R 3.5.3)，统计量使用U表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

1345名受试者中，包括888名健康受试者及457例患者(表1)，结果显示健康受试者和患者的孢子数呈偏态分布。

表1 研究样本信息 例(%)

2.1 健康皮肤不同年龄、不同部位的真菌载量的比较 健康受试者三个不同部位的孢子数量不同，差异有统计学意义，故认为健康组不同部位的孢子数量不同(表2)。健康受试者四个年龄组的同一部位比较(表3)，头皮、干燥部位、潮湿部位和足底的孢子数量没有显著差异，但皮脂溢出部位的孢子数量差异有统计学意义。

表2 健康受试者不同部位孢子数量统计分析结果

表3 健康皮肤不同年龄相应部位的真菌载量的比较

2.2 健康皮肤和炎症性皮损的真菌检出率(表4) (1)健康志愿者头皮和皮脂溢出部位的真菌检出率均很高(90%以上)，足底真菌检出率最低(44.29%)，潮湿部位和干燥部位的检出率相近。(2)AD的潮湿区域真菌检出率最高，而该区域也是该病的皮损好发部位。(3)湿疹不同部位真菌检出率不同，皮脂溢出部位>潮湿部位>干燥部位>足底，分别为77.05%、68.97%、58.93%和26.92%。(4)银屑病的头皮处真菌检出率为54.54%，皮脂溢出部位为66.67%，干燥部位为47.62%。(5)PR的皮脂溢出部位真菌检出率为91.42%，干燥部位检出率为57.89%。

2.3 健康皮肤与炎症性皮损同一部位的真菌检出率比较(表4) (1)健康组头皮部位的真菌检出率(95.05%)高于银屑病组(54.54%)，差异有统计学意义；(2)健康组皮脂溢出部位的真菌检出率为96.26%，高于其余的4个疾病组，而健康组与疾病组对比，除PR组外，其余疾病组与健康组的差异均有统计学意义；(3)健康组干燥部位的真菌检出率为83.16%，高于4个疾病组，且疾病组与健康组差异有统计学意义；(4)健康组潮湿部位的真菌检出率(83.67%)高于AD组(77.78%)和湿疹组(68.97%)，但差异并无统计学意义；(5)健康组足底的真菌检出率(44.29%)高于湿疹组(26.92%)，差异有统计学意义。

表4 健康皮肤和炎症性皮损相应部位的真菌检出率比较

2.4 健康皮肤与炎症性皮损同一部位的真菌载量比较(表5) 除健康组与AD组潮湿部位孢子数量无显著差异外，健康组与4个疾病组的其余相应部位的孢子数量差异均有统计学意义，且健康皮肤的孢子载量高于皮损部位。

表5 健康皮肤与炎症性皮损相应部位的孢子载量比较

3 讨论

众所周知，皮肤表面黏附着各种各样的微生物，包括细菌、病毒、真菌、昆虫等，它们与人类宿主之间的相互作用及其机制相当复杂。皮肤屏障被破坏或共生菌与病原体之间的平衡紊乱可导致或加重皮肤病，甚至出现全身性疾病[7]。其中，马拉色菌是人类正常皮肤上最常见的定植真菌，占真菌菌群的 50%～80%[9]。

快速准确的真菌检测方法是判断皮损真菌载量的首要因素。以往多采用真菌培养、分子方法学、氢氧化钾(KOH)湿片法等，各有弊端。其中，真菌培养受不同种属生长速度和培养要求的影响，检出率低[10]；分子生物学方法受样品中真菌核酸载量、样品污染、DNA提取等因素限制。KOH湿片法由于显微镜下不易识别真菌结构、检验员经验限制而降低了检测阳性率。真菌荧光染色法利用可特异性结合真菌细胞壁上的几丁质和葡聚糖的荧光染料，菌丝或孢子会发出蓝绿色荧光，使结构易于识别[11]。真菌荧光染色法优于传统的KOH湿片法，不仅具有快速、简便、灵敏、阳性率高等优点[12]，而且可以在显微镜下直接观察真菌的数量，是检测皮肤中真菌定植量和定植率的较好方法。

本研究显示，健康受试者不同部位的孢子数量不同，以皮脂溢出部位的孢子数量最多，提示油脂部位的真菌定植密度最大，可能与部分真菌的嗜脂性(如马拉色菌)有关。正常人群不同年龄段的皮脂溢出部位的真菌定植量有区别，以18～44岁年龄段的孢子居多，其余部位差异无统计学意义，提示年龄是皮脂溢出部位的真菌定植量的影响因素之一。如马拉色菌，在人出生后即开始在皮肤表面定居，并持续到6～12个月，随后定植减少并保持低水平，直到青春期的皮脂腺活动增加，提供了马拉色菌种群所需的脂质[13]。

关于皮肤最常见的定植真菌-马拉色菌的研究最多，但其定植密度与AD疾病严重程度的相关性尚有争议。本研究发现，除健康对照组与AD患者潮湿部位的真菌检出率、载菌量并无统计学意义外，AD组皮脂溢出部位及干燥部位的检出率及载菌量均低于正常人。

AD是一种慢性炎症性皮肤病，儿童期和青年期多表现为亚急性、慢性湿疹状，好发于四肢屈侧，尤其是肘窝和腘窝等潮湿部位[14]。AD患者由于皮肤干燥，容易受到病毒、细菌和真菌的感染，从而损害皮肤的屏障功能[15]。AD的表皮屏障功能受损，同时由于瘙痒而搔抓加剧皮肤屏障损害，激活AD患者的先天免疫和增强获得性免疫[16,17]。然而，决定表皮屏障正常功能的关键是维持其酸性外表面和碱性内表面之间的pH梯度，该梯度驱动着生物膜的许多重要功能，如马拉色菌这样的共生生物的作用则会加剧这种屏障形成过程中的遗传缺陷[18]。亦有研究表明，AD患者的皮脂含量与疾病的严重程度呈负相关[19]，而皮脂含量的降低无益于马拉色菌的定居，这或许可解释健康对照组的皮脂溢出部位、干燥部位孢子数量较AD患者的相应皮损部位升高的原因。近年也有文献提示，马拉色菌可能对青春期后AD有保护作用[13]，故真菌与AD之间的确切作用有待商榷。

真菌感染可能在湿疹的发病中起作用。与AD组类似，健康对照组的皮脂溢出部位、干燥部位、足底的孢子数量均较AD患者的相应皮损部位多，这可能与临床上大部分形态不典型的“AD”被诊断为“湿疹”有关。

白念珠菌和糠秕马拉色菌与银屑病的发生有关[20]。本次研究显示，银屑病组头皮、皮脂溢出部位及干燥部位的检出率及载菌量均低于正常人。既往也有研究表明，银屑病患者马拉色菌定植水平低于正常对照组，但马拉色菌定植水平与银屑病皮损面积和严重性指数(PASI)无显著相关性[21]。因此，真菌定植与银屑病的关系仍需深入研究。

本研究中，PR的皮脂溢出部位及干燥部位的真菌定植密度比正常人皮肤的真菌定植密度降低。PR与细胞免疫有关，然而，真菌感染也可引起细胞免疫紊乱。廖家等[22]认为PR的发病可能是微生物感染后，朗格汉斯细胞将微生物半抗原递呈给邻近的淋巴细胞使其致敏，当这些致敏的淋巴细胞再次接触此类抗原的时候，会立刻释放一系列细胞因子吸引炎症细胞，进而引起迟发型变态反应，同时，产生CD8+效应T细胞会直接攻击抗原，从而致使皮肤炎症反应的发生，促进了PR的发生发展。真菌感染亦可引起细胞免疫失调，由此我们认为真菌定植紊乱与PR之间存在某种关联。

目前真菌在皮肤不同部位的分布数量和阳性率还没有相应的参考值，这也是本研究的探讨目的之一。研究结果表明，正常皮肤的真菌载量和携带率均高于炎症性皮损区域，表明真菌是炎症性皮肤病的保护因素而不是有害因素。本研究结果还显示，真菌定植的数量与皮脂腺的分布有关，不同年龄阶段健康人皮脂溢出部位的孢子数量差异可能是由于皮脂腺数量的不同造成的。此外，与肠道菌群移植类似，鉴于健康受试者的真菌高携带率，移植健康皮肤菌群修复炎症性皮损可望成为皮肤微生物治疗研究领域的重要方向。

综上所述，皮肤是一个活跃的免疫器官[23]，本研究发现健康人皮肤和炎症性皮病中真菌的阳性率和载量不同。因此，微生物干预可能是一种更温和、更有价值的手段，代替传统药物预防或治疗炎症性皮肤病，从而提高患者的生活质量及满意度。