空卵泡综合征的最新研究进展

郑明明 魏超峰 连方

空卵泡综合征(empty follicle syndrome，EFS)是一种在体外受精(in vitro fertilization，IVF)过程中经过控制性超促排卵但没有成熟的卵母细胞被取出的现象。1986年由Coulam等[1]最早报道，在辅助生殖技术的促排卵周期中，卵泡大小和体内激素水平均正常，但通过重复冲洗和操作仍不能从成熟的卵泡中获取卵母细胞。2008年，Stevenson等[2]首次将这一现象具体分型，提出真性空卵泡综合征(genuine empty follicle syndrome，GEFS)与假性空卵泡综合征(false empty follicle syndrome，FEFS)的概念。GEFS比较复杂且预后不佳，是一个受多种因素影响的棘手问题。FEFS通常被认为是由于取卵日β-人体绒膜促性腺激素(β-HCG)较低(<40 mU/mL)导致不能取到卵母细胞，往往由外界因素如人为或药物使用不当所造成。因此，对于临床工作者需要在IVF周期中尽量消除诸类因素从而避免FEFS的发生。本文就两种不同性质的空卵泡的病因、治疗、预防及预后等方面进展论述。

一、EFS病因

1. GEFS病因：目前对于EFS病因有很多研究，但确切的机制仍不清楚，研究发现GEFS的发生与以下因素有关。

(1)年龄。对于女性来说，研究显示[3]生育力与年龄成反比，流产率、畸形率和空卵泡发生率随着年龄增大也会增加，尤其是年龄大于44岁的女性。据报道GEFS的复发率随着年龄的增长而增加[4]。Baum[5]回顾性研究了大量EFS患者，包括复发性患者，评估了该群体随后的生育情况，发现GEFS的出现与年龄增长有密切关系，同时也与某些激素水平的异常相关。

(2)卵巢老化。卵巢功能和卵泡储备是一个女性生育功能的体现，其生育能力的下降与卵巢功能的变化密切相关，卵巢老化表现出卵泡不断耗竭的状态、卵泡池的卵泡数目下降等，这都是生殖能力下降的表现。卵巢作为重要的生殖器官受各种因素的影响[6]：遗传学因素、免疫因素、医源性因素和环境因素都可能对卵巢产生损害，在这些诸多不良因素作用下卵巢逐步老化。Zreik[4]认为卵巢老化以及卵泡耗竭的卵泡发育异常可能是导致EFS出现的一个重要因素。

(3)卵巢储备功能降低。卵巢储备是评价生育力的一项重要指标，除了窦卵泡数目的减少，卵泡质量的下降也是卵巢储备功能降低的重要表现，这可能导致在IVF过程中即使对卵巢进行适当的刺激后仍不能从成熟卵泡中抽吸出卵母细胞。Madani等[7]回顾性分析了58例EFS患者，其中48例诊断为GEFS，该研究发现这些患者血清抗缪勒激素(AMH)低，成熟卵泡少。Yakovi等[8]的前瞻性研究也得出同样的结论，由此分析卵巢储备低可能是EFS的一种发病原因。但也有研究[9]结论相反，该研究涉及的患者中只有4.25%有卵巢储备功能(diminished ovarian reserve，DOR)下降，但31.9%的EFS病例有多囊卵巢综合征和不明原因的不孕症，且AMH水平为(4.47±3.54)ng/mL，窦卵泡计数(antral follicle count，AFC)为(15.30±8.07)，表明卵巢储备减少不是EFS的主要因素。

(4)卵母细胞过早闭锁。卵母细胞的发育需要颗粒细胞支持，Inan[10]利用Affymetrix基因芯片分析复发性EFS患者颗粒细胞(granulosa cells，GC)的全基因表达，发现空卵泡患者的颗粒细胞基因表达出现明显改变，差异表达基因水平的变化可能预示着其封闭卵母细胞的质量，凋亡基因的异常增加以及与卵泡正常生长的转录物的减少都有可能造成卵母细胞的缺失。由此认为GEFS患者的卵母细胞在早期就发生了闭锁。

(5)基因和遗传因素。人卵子透明带(zona pellucida，ZP)是包裹在卵母细胞周围的一层半透明的由ZP1、ZP2、ZP3和ZP4四种糖蛋白构成的膜状结构。由于ZP蛋白的密度、结构和相互作用与卵泡质量有关，所以卵母细胞质量异常可以通过ZP形态和结构的异常来预测。Sun等[11]通过对来自同一家庭的两位患EFS的姐妹使用HCG和/或GnRHa进行三个周期的标准的卵巢刺激后，通过测试将全外显子组测序和共分离，发现其均存在ZP1基因突变，进一步分析证实ZP1、ZP2和ZP3蛋白会被突变的ZP1蛋白中断其之间的相互作用，最终破坏卵母细胞透明带的形成，由此提出ZP1基因的特定突变可能为EFS的病因。这种观点在Yuan等的研究[12]中也得到证实，且发现了ZP1基因上新的突变点c.181C>T (p.Arg61Cys)。此外，Dai等[13]又发现了ZP1基因上的6个新的突变点，进一步推测ZP1的缺失可能导致卵母细胞变性或在滤泡穿刺过程中卵母细胞脆性增加，最终导致EFS。Chen等[14]对复发性EFS女性全基因组连锁分析和全外显子组测序，发现在ZP3基因上存在 c.400 G>A (p.Ala134Thr) 突变，认为ZP3突变使ZP的组装受阻和卵丘细胞与卵母细胞之间的通讯受阻，导致卵母细胞变性。Zhou等[15]发现了新的突变点，包括 ZP1中的3个纯合突变 (c.1708G>A,p.Val570Met；c.1228C>T，p.Arg410Trp；c.507del，p.His170Ilefs*52)，ZP1中的2个复合杂合突变(c.1430+1G>T，p.Cys478X 和c.1775-8T>C，p.Asp592Glyfs*29)，ZP2中的1个纯合突变(c.1115G>C，p.Cys372Ser)，以及ZP3中的1个杂合突变 (c.763C>G，p.Arg255Gly)，并提出ZP1，ZP2和ZP3中的突变可能影响相应的蛋白质表达，分泌和相互作用，从而为EFS提供了新的机制解释，并扩展了ZP基因突变的范围，进一步阐释了ZP基因突变的致病机制。由此认为基因突变的异常对卵泡发育过程中物质表达的影响会对卵母细胞产生不利影响。

Chen等[16]首次报道在同一家系中2例EFS的发生是由于促黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体(luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor，LHCGR)基因突变导致。最近国内的研究[17]也进一步证实LHCGR基因突变与EFS的关系。也有报道[18]研究发现一个来自中国的非近亲家庭的GEFS患者循环LH水平正常，尽管卵巢储备和反应令人满意，但在两次IVF循环后仍未取得卵母细胞，通过检测发现其和父母LHGR基因皆出现一个新的纯合突变，对其信号研究发现该突变对LHCGR在不同浓度下对hCG或LH的反应具有不同的影响，具体而言，在浓度<1 IU / mL时，该突变体被hCG刺激激活，但部分抵抗LH刺激。在较高浓度(>1 IU / mL)下，突变体被hCG和LH激活。这些数据表明，对LHCGR基因突变的筛查可能有助于GEFS患者的诊断。

同时也有研究发现遗传因素如染色体的异常也会影响女性的生育力。目前可知某遗传物质如核型异常可影响女性的生育能力，Onalan等[19]报道了2例原发性不育的耳聋姐妹，经过3次IVF或卵泡浆内单精子注射技术的周期，尽管再次注射HCG，且测定其注射日的E2、P、LH无异常，但FES仍然复发。Vujisic等[20]报道一例有过自然流产史的32岁继发性不孕女性，后虽多次行辅助生殖周期治疗包括自然周期和促排卵周期仍不能成功获得卵母细胞，行染色体核型检查为2号染色体臂间倒位：46，XX，inv(2)，(p11q21)；男方染色体正常。由此认为遗传物质缺失导致出现的遗传体征可能会影响生殖细胞的正常发育功能，这为EFS的遗传学基础和不育个体的遗传学诊断提供了新的证据。

2. FEFS病因：FEFS通常由于人为因素或药物应用不当导致。积极探究其机理并寻找有效干预措施和解决方法以改变患者结局十分重要。研究发现FEFS发生与下列诸多因素有关。

(1)HCG生物活性异常。卵泡排出需要LH峰的出现，排卵前LH峰会使得卵母细胞产生形态学改变包括卵母细胞重新启动减数分裂以及颗粒细胞发生黄素化，随后在卵丘颗粒细胞团扩张和黏液化基础上卵泡壁破裂、卵子排出。HCG与LH结构及生物活性相似,若使用的HCG的生物活性异常，也会造成卵泡成熟和排卵障碍而导致FEFS的发生。

(2)HCG的用量不当。有学者[21]研究患者的三个IVF周期，在前两次失败后第三个周期通过双重触发超正常剂量的人绒毛膜促性腺激素(HCG)结合延迟的卵母细胞回收方法来诱导排卵，重组HCG和尿HCG，结局取卵10枚，受精2枚，成胚2枚。排卵需要卵冠丘复合体及颗粒细胞从卵泡壁上脱离，一定剂量的HCG在这个过程发挥重要作用。颗粒细胞上LH受体的适量表达支持着卵泡的发育，这使得LH完全取代FSH作用[22]。若卵泡发育不良，卵母细胞周围的卵丘早期萎缩退化或出现自发性LH峰均可出现排卵障碍。目前LH峰的正常范围不确定，使得排卵前注射HCG的最小有效剂量也尚不清楚，当前临床一般推荐最小剂量为5 000 IU。但在最新的病例报道[23]，1名38岁的女性扳机时不慎使用了2 000 IU的HCG，最终获得14枚卵母细胞，其中12枚处于MII期，经卵母细胞胞浆内精子注射(ICSI)后9枚受精，形成8个囊胚，PGS显示有3枚为整倍体，移植1枚D6胚胎，目前为宫内妊娠，此病例提示低剂量的HCG也有可能促进卵母细胞成熟，且受精和妊娠情况良好。

(3)HCG的使用时间不当。临床一般在注射HCG后34～36 h取卵，过早注射或过迟使用都可能造成颗粒细胞对HCG不能做出恰当的反应，使卵母细胞不能在合适的时间排出，导致错过最合适的受精时机。雌激素对于排卵也有重要影响，当雌激素达到一定水平后，LH峰没有采取恰当的抑制措施，则可能会发生卵子“逃逸”，使卵丘复合物从卵泡壁上脱落。不同患者可能对于HCG的作用时间不同，对于需要HCG作用时间较长的仍按常规注射后34～36 h取卵，就可能导致FEFS的发生。Song等[24]在GnRH-拮抗剂方案中，使用促性腺激素释放激素激动剂扳机后6 h实施了双触发给药，结果获得11个卵母细胞行IVF。18 h后，7个卵母细胞显示正常受精，72 h后形成2个胚胎，说明卵母细胞成熟和排卵是时间依赖性过程，需要根据不同患者情况来调整时间间隔。

(4)HCG代谢清除率速度。HCG体内代谢清除速度在不同患者之间是有一定差异的，肥胖患者与正常人群有一定差异。不同给药途径的HCG代谢率也不同，当发生FEFS时，还要将这些因素考虑进去。

(5)促排卵方案。促排卵方案与FEFS之间的关系尚不明确。但 Singh等[9]基于医院的研究中心进行的一项回顾性研究中，对2010年1月至2016年8月的IVF周期进行了研究。GnRH激动剂、拮抗剂和微刺激方案用于IVF周期，结果发现：EFS的发生率为2.38%(47/1 968周期)，其中拮抗剂方案组(占76.59%，36/47)的EFS发生率(6.69%)最高。但关于促排卵方案可能会受到其他因素影响，目前不能确定其与空卵泡的关系。

(6)扳机药物的影响。关于不同的扳机药物与FEFS发生的相关性尚存在争议。Castillo等[25]的大型回顾性研究分析表明，HCG触发和GnRHa触发相比，FEFS发生率无显著性差异(3.5%vs3.1%)。

二、治疗及预防

GEFS的病因研究尚未完全清楚，这给临床的预防与治疗带来了巨大的挑战，对于卵巢原因及基因异常导致的会出现复发可能性且预后不良者，赠卵可作为一种选择。Deepika等[26]报道了1名诊断为GEFS的患者，连续2个周期均未获得卵子，第3个周期中运用了GnRH-a和HCG双扳机以后，获得了11枚卵，移植了2枚囊胚，最终成功妊娠及分娩。但该研究仅1例患者，双扳机能否改善GEFS的结局尚不明确。最近报告了一例复发性EFS患者，在两个不同的体外受精周期中，使用两种不同的方案均未获得卵母细胞，且第二周期在第二次注射HCG补救后，经过24 h后抽吸一侧卵巢仍未获得卵母细胞，提示改变治疗方案或重复HCG给药不太可能改变GEFS的结局[27]。对于人为因素或药物作用导致的FEFS可从以下方面挽救：

1.再次注射hCG 24～36 h取卵：Revelli等[28]提出HCG的给药时间是导致取卵周期失败的重要因素。诸多研究关于取卵日血β-HCG的水平临界值有不同报道，Stevenson等[2]提出血β-HCG<40 mIU/mL为是否再次注射HCG的判定指标。Christopoulos等[29]报道6名患者在使用GnRHa触发后发生EFS，5例患者经注射HCG抢救后36 h再次穿刺获得成熟卵母细胞。

2. 调整穿刺时间：临床一般在注射HCG后36～40 h取卵，注射HCG与取卵的时间需要合适的间隔以助于卵母细胞在HCG下更充分暴露并对其做出恰当反应使卵母细胞成熟排卵。临床研究中发现卵母细胞重新启动减数分裂需要HCG峰值浓度持续14～18 h左右，成熟卵母细胞的获得则而在HCG峰28 h之后。Sahebkashaf等[30]对108个患者的119个FEFS周期进行分析，正常卵巢刺激取卵失败后停止采卵，6 h后重新穿刺，取卵成功。有学者[31]提出适当延长HCG暴露时间对于PCOS患者可促使卵母细胞复合物与卵泡壁充分分离促进卵子最终成熟，提高卵子质量和临床妊娠率。

3. 取卵技术的改善：取卵和捡卵速度要一致，这个对于临床医生的实践技术操作和相互配合提出更高的要求。若穿刺数个优势卵泡发现无卵子且颗粒细胞少时，应停止操作重新取卵，积极寻找原因采取补救措施以争取挽救周期。

4. 换用不同批次的HCG：由于HCG的生物活性降低造成的卵泡成熟或排出障碍而发生FEFS的可能与药品在生产、包装或储存中存在偏差有关，因此出现诸类情况可考虑换用不同批次药物以挽救周期。

三、结语

目前EFS在临床中是一个棘手问题，受诸多因素影响且复发可能性较大。无论从心理、情感、身体、还是经济方面对患者来说都是创伤性的。因此，评估患有EFS的患者在未来治疗中是很有意义的。现代医学技术的发展为临床诊疗提供了辅助手段以便动态检测相关激素水平和卵泡发育。基本资料的完善对于医生和患者都尤为重要，通过对其资料的分析以及建立资料库与各学科分工来帮助进一步研究GEFS和FEFS，这对空卵泡综合征的诊治和发病机理探究有重大意义。总之，了解EFS病因，掌握EFS的预防措施和有效补救措施是十分必要的，这有利于减轻患者的心理压力和减少经济损失、促进医学进步。由于受影响因素较多使得EFS的研究 仍然困难重重，阻力较大，还要走相当长的探索之路。