乳腺癌分子诊断的应用进展

郏莉莉，张喆

(江苏省肿瘤医院，江苏省肿瘤防治研究所，南京医科大学附属肿瘤医院 病理科，江苏 南京 210009)

根据2020年国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC) 发布的统计数据，乳腺癌已经成为全球发病率最高的癌症[1]，也列45岁以下女性恶性肿瘤死亡原因的第一位[2]。乳腺癌具有高度肿瘤异质性，并且发病机制尚不明确[3]。早发现、早诊断、早治疗对降低乳腺癌患者的死亡率和改善预后有重要作用[4]。

分子诊断是指用分子生物学方法检测患者体内DNA、RNA或蛋白质分子的结构、表达、表观遗传特异性改变的方法和过程[5]。通过分子诊断收集到的资料有助于肿瘤的诊断、分型、推测预后，并且可以结合临床资料和病理诊断结果对患者进行个体化的精准治疗。作者就乳腺癌分子诊断技术的应用进展进行综述。

1 乳腺癌的分子诊断技术

1.1 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术

FISH技术的原理是将荧光素直接或间接标记的核酸探针与待测样本中的核酸靶序列按碱基互补配对原则进行杂交，之后通过荧光显微镜直接观察和分析细胞核内染色体上的基因状态[6]。可以在荧光显微镜下对荧光标记的DNA序列进行定性、定量或相对定位分析。FISH技术是乳腺癌分子诊断中应用最广泛的一种检测手段。蒋依娜等[7]用FISH法检测568例免疫组化表达为2+的HER2基因扩增不确定病例样本的基因状态，认为FISH法可靠性和准确性更高。陈辉等[8]用FISH法检测HER2非典型扩增和不确定状态的乳腺癌样本共336例，发现非典型扩增和不确定的病例均有典型的雌激素受体阳性。双倍体/多倍体的病例更具有侵略性。

1.2 实时荧光定量聚合酶联反应(quantitative realtime PCR, qRT- PCR)技术

qRT- PCR是对PCR扩增中添加荧光基团并对全程进行实时监测，根据反应时间和荧光信号变化绘制成曲线并进行定量分析。陆慧琦等[9]用qRT- PCR法测定乳腺癌组织中人表皮生长因子受体2(human epithelial growth factor receptor- 2,HER2)基因表达，并用免疫组化法印证，认为用qRT- PCR法进行相关指标的检测，可为临床对乳腺癌患者术后选择合理治疗方案提供依据。邓艳华等[10]应用双标准曲线的qRT- PCR检测HER2在乳腺癌临床诊治中的可行性，实验用FISH法作对照，结果发现,双标准曲线的qRT- PCR法检测HER2基因扩增水平准确可信。

1.3 基因芯片技术

基因芯片技术是把大量已知序列探针集成在同一个基片上，通过碱基互补配对的原则，将标记的靶核苷酸序列与芯片特定位点上的探针杂交，通过检测杂交信号，对细胞或组织中的基因信息进行分析。基因芯片技术可以一次性检测同一组织中数千个基因表达谱的差异，学者们将其应用到乳腺癌诊断和治疗中，可以通过检测对比乳腺癌组织和正常乳腺组织基因之间的表达差异，从而筛选出与乳腺癌发生发展相关的基因，用于乳腺癌的治疗和预防。张莉等[11]筛选乳腺癌基因芯片中差异表达的差异非编码RNA，并分析其在乳腺癌中的表达情况；魏选东[12]从欧洲分子生物学实验室获取乳腺癌基因芯片，并对芯片数据进行挖掘，筛选出决定乳腺癌预后的核心基因，并评估其对预后的预测效果。

1.4 高通量测序技术

高通量测序又称为“新一代”测序技术(new generation sequencing technology，NGS)，可以一次同时对几十万到几百万条DNA分子进行测序，并且可以短读长测序[13]，其高通量很大程度上节约了检测时间，在保证准确性的前提下也降低了成本。NGS是目前主流的肿瘤患者基因检测手段，其为疾病的鉴别诊断、预后预测和患者的个体化、精准化治疗都提供了重要的依据。孙思等[14]利用NGS分析遗传性乳腺癌患者BRCA1/2基因遗传突变的情况，发现有家族史乳腺癌患者BRCA1/2基因的有害变异率显著高于正常对照组，利用NGS可以有效地进行家系遗传分析，并可以有效筛选出乳腺癌BRCA1/2基因的突变。Roy- chowdhuri等[15]通过NGS分析454个乳腺癌样本，其中包含46个乳腺癌常见癌基因，经检测发现TP53基因突变率高达38.8%，表明可能存在乳腺癌治疗的潜在靶点。

1.5 基于NGS的循环肿瘤DNA检测

在目前的临床诊断中针对乳腺癌的确诊和分子分型的检测采用的都是患者的肿瘤组织样本。但是肿瘤组织样本受到使用损耗局限检测次数、再次取材的困难以及穿刺活检样本肿瘤异质性可能影响检测结果的种种局限，仅使用患者既往手术切除的肿瘤样本或者穿刺活检组织样本已经无法满足不断发展的患者术后肿瘤状态动态监测和个体化治疗的需求，液体活检技术(liquid biopsy)对乳腺癌的诊疗和动态监测起到了重要作用，检测循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)成为新兴热点[16]。

ctDNA是肿瘤细胞释放至外周血中的单链或双链DNA，目前对ctDNA的检测方法是在NGS基础上进行的，通过选定一定数量的乳腺癌相关基因，对外周血中的ctDNA进行测序。根据对基因富集策略的不同分为靶向扩增子测序(targeted amplicon sequencing，TAS)和目标序列捕获测序(targetde capture sequencing，TCS)[17]。易宗华等[18]用NGS和TCS检测804例转移性乳腺癌患者ctDNA样本中TP53基因的突变情况，发现外显子5- 8的TP53突变是转移性乳腺癌患者无病生存期短的独立预后指标。

2 分子诊断技术的优缺点对比分析

FISH所用的荧光素没有放射性，清洁安全；实验周期短，探针稳定性好，定位准确，特异性高，得到结果用时短；其经过多次免疫化学反应，杂交信号增强，灵敏度增高；多荧光通道可检测同一细胞核中的多种序列；既可以在玻片上显示中期染色体数量和结构的变化，也可以在悬液中显示期间染色体DNA结构[19]。其不足是：检测费用较高；实验条件要求严格，实验操作人员和判读人员都需要具备专业知识和操作资质；待测样本在荧光显微镜下无法直接观察组织结构形态，难以区分癌组织和其他组织；最终制作完成的切片荧光信号会随时间衰减，无法长期保存[6]。

qRT- PCR的优点体现在标本来源容易，定量范围宽，检测结果准确度高，灵敏度高，特异性强，可重复性好，检测方便快捷，实验过程全封闭，自动化程度较高，并且具有高通量的优势；其缺陷为无法检测扩增产物的大小，实验成本较高且受到荧光素种类和检测光源的局限[20]。

基因芯片技术显著优点是高通量检测、特异性强、自动化操作和快速高效；不足为技术成本高、工序复杂、DNA芯片上原位合成探针时容易混入错误的片段或者杂质造成污染等。

NGS优点是通量高、耗时短、精确性高，污染可能性极低，可以用于观察表观遗传过程、验证癌症因果关系、推测肿瘤进展和指导疾病治疗；不足在于成本高、操作难，对数据分析平台要求高，需要强大的计算机平台支持和专门的公司进行数据和图像处理分析、存档分类。

ctDNA检测的优点是创伤小、取材方便、灵敏度高，可持续监测；其缺点是ctDNA含量低、易降解，需要高浓度的ctDNA、检测成本高。

虽然FISH检测费用比免疫组化检测高，但比qDNA、基因芯片、NGS、ctDNA检测低，FISH也是目前识别HER2基因拷贝数的金标准，可以直接指导临床靶向用药；qPCR对拷贝数变异、突变检测无法检测；基因芯片技术虽然有高通量的优点，但是其探针合成易造成污染，也无法对待测基因进行精确定位；NGS虽然成本高而且对分析平台要求很高，但是可以进行高通量多位点和未知基因突变的检测，可以为乳腺癌的治疗筛选更多靶标；ctDNA检测可以通过外周血中的ctDNA检测基因突变和对肿瘤发展进行持续的动态监测。

3 总结与展望

分子诊断技术目前已经普遍应用于临床诊断和治疗，同时广大临床医生和科研人员也使用分子诊断技术进行科学研究，在分子诊断技术的支持下，科研人员可以对乳腺癌的基因突变、早期诊断、靶向用药、预后判断有更深入透彻的研究。虽然分子诊断技术在临床上的使用已有时日，但由于平台和技术资源的要求限制，并不是所有医院都具备建立分子实验室的能力。在检测质量方面，由于各种检测的方法有不确定性，所以目前并没有关于检测的统一标准，各个实验室的质量水平也很难统一评估；另一方面分子检测的成本高，患者往往会有经济上的顾虑，需要临床医生对患者的病情作全面评估并同时考虑患者的经济情况，针对不同需求合理选择一种或多种分子检测方法，相互发挥优势、弥补不足，使患者得到更精准的治疗和预后相关的动态监测。科技推动乳腺癌分子诊断技术走进了新时代，在未来除了对未知领域的探索，更需要建立业内统一认可的诊断标准，更精准地为患者提供个体化治疗，让更多的乳腺癌患者从中获益。