吗替麦考酚酯对阿尔茨海默病大鼠海马自噬蛋白Beclin-1与LC3表达的影响

宋皓

（山西医科大学晋祠学院，山西太原 030025）

阿尔茨海默病属于常见神经退行性的疾病，其临床特征主要为渐进性认知功能出现障碍、出现行为损害。有报道结果显示，Aβ蛋白的沉积可诱导脑内小胶质细胞、星形胶质细胞的激活，并能参与体内的免疫应答，分泌大量炎性因子，例如白介素6、干扰素，从而影响神经炎性的反应，致使阿尔茨海默病发展[1]。目前，世界各国的医疗工作者和有关专家已就这种疾病的致病机理以及治疗方法等进行了研究，并取得了很多新的进展。然而，由于大脑的复杂性，当前还未找到一种理想的治疗方法，尽管有100多种潜在治疗阿尔茨海默症的药物参与了临床试验，但最终保留下来的公认安全、有效的治疗药物却仅有三四种[2]。而吗替麦考酚酯就是其中之一，它是一种免疫抑制剂，是一种前体药物，其进入人体之后水解成霉酚酸而产生免疫抑制作用。在细胞内将受损细胞器降解的自噬行为为细胞的生存提供物质及能量。有报道显示，阿尔茨海默病特点之一为自噬活性的降低，相关研究明确，Beclin-1蛋白及LC3在自噬通路中分别发挥着诱导自噬的启动和促进自噬小体成熟的作用[3]。Beclin-1与LC3两种蛋白均在阿尔茨海默病的患者脑内呈现低表达。本文主要通过SD雄性大鼠制作的阿尔茨海默病大鼠模型，研究分析吗替麦考酚酯对其海马自噬蛋白Beclin-1与LC3表达的影响。

1 资料与方法

1.1 药物、实验器械

吗替麦考酚酯（国药准字H20059282，0.5 g），重庆莱美药业股份有限公司；多奈哌齐（国药准字号H20030472，5 mg），江苏豪森药业集团有限公司。

51600型大鼠的脑立体定位仪，上海玉研科学仪器有限公司；STELLARIS 5共聚焦显微镜，德国Leica公司；JS-2000凝胶成像仪，上海培清科技有限公司。

1.2 实验动物

选取质量为（250±30）g的SD雄性大鼠，来源于北京军事医学科学院的实验动物中心。所有选取的大鼠均在温度（24±4）℃、湿度（39±9）%的环境下适应性饲养1周以后进行实验。

1.3 制作模型方法、分组方法及用药

（1）模型的制作。应用戊巴比妥钠腹腔的方法对大鼠进行麻醉，在大鼠的脑立体定位仪上固定其头部，切开皮肤，露出其颅骨，对前颅进行定位，并在前颅后面1.5 mm、旁开0.8 mm的位置定位侧脑室，颅骨钻孔，骨窗的直径大约为2 mm，通过微量注射器注射2 μL的Aβ25-35，缓慢进针，保持4 mm的深度并回退1 mm，缓慢注射5min且需留针5 min，退针后缝合皮肤，用碘伏消毒[4]。1组于侧脑室注射2 μL的生理盐水，其他3组注射2μL的Aβ25-35，注射方式同前，存活下来的大鼠进行实验。

（2）实验分组及用药。实验分为1组、2组、3组、4组。1组（对照组）：每天注射0.9%的等量生理盐水（无菌），40 d不间断注射；2组（模型组）、3组（给药组）以及4组（阳性对照组）：每日注射一次标准为120 g/kg的D-半乳糖。其中，2组每天给予0.9%的等量生理盐水（无菌），3组每天一次吗替麦考酚酯，剂量为0.2 g/次，4组为多奈哌齐（阳性对照）组。每组10只，所有大鼠在清醒之后给药，均使用对应药物作灌胃处理，且持续给药4周。

1.4 识别实验

用不透明的检测箱对大鼠进行3个阶段（适应、训练、检测）训练[5]。适应阶段：检测箱内无任何物体，将大鼠放置箱内活动5 min，再将大鼠取出；训练阶段：将2个相同物体放于检测箱内，并将大鼠背对物体放置，让大鼠对2个物体熟悉，10 min后将大鼠取出；检测阶段：原检测箱内2个相同物体取出1个，并重新放置1个形状不同新物体，将大鼠放置箱内活动5 min，记录大鼠舔咬、蹭擦新物体的时间或者鼻子挨近新物体1 cm内的范围，即属于大鼠对新、旧物体探索的时间。3个阶段的训练均需间隔24 h，且每次、每只大鼠放置检测箱之后，均用乙醇擦拭检测箱及所有物体。用识别指数（DI）评价大鼠对不同物体探索的时间，按公式（1）计算。

式中：N为大鼠对新物体探索消耗的时间，s；F为大鼠对熟悉物体探索消耗的时间，s。

1.5 水迷宫实验

注入温度为（23±3）℃清水于水迷宫桶内，水面高过平台，且高出2 cm，加入蓝墨水。逃避潜伏期：等距离将水桶上缘分为4个点，大鼠面对池壁从任意1个点入水，游到平台且站到平台时间。每只大鼠每天记录1次逃避潜伏期，连续记录5 d，同时记录5 d游泳距离，取平均值。第6天取消平台，大鼠从任意1个点入水，记录大鼠1 min之内到原平台次数，检测大鼠记忆[6]。

1.6 HE染色

行为学实验后，将每组大鼠深度麻醉，开胸暴露心脏，从左心室刺入主动脉，先快速灌注磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4，4 ℃），再灌注4%多聚甲醛溶液（溶解于PBS，4 ℃）固定。断头取脑，将脑浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定保存（4 ℃），用石蜡包埋海马，制成5 μm厚度切片，后经HE染色，显微镜下观察拍照。从每个大脑中选择4～5片进行分析，每个切片同一个平面范围内脑组织神经元受损情况重复分析两次[7]。

1.7 蛋白质印迹法检测

运用蛋白质印迹法对提取自海马区的蛋白进行检测。通过制胶、电泳、封闭、一抗孵育过夜，LC3及Beclin-1以及内参β-actin一抗浓度根据说明书稀释。二抗孵育1 h之后，将膜放在凝胶成像仪，加发光剂，将显影曝光，以Image J分析Beclin-1、LC3蛋白的表达情况。

1.8 统计学方法

本研究数据运用SPSS 19.0统计分析，计量资料以±s表示，组内均数用one-way ANOVA，组间均数用LSD-t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 各组识别指数、穿环次数、游泳距离、潜伏期的对比

由表1可知，与第1组相比较，第2组识别指数及穿环次数均显著下降，潜伏期及游泳距离显著增加，且P均＜0.05；与第2组相比较，第3组、第4组识别指数及穿环次数均显著增加，潜伏期及游泳距离显著下降，且P均＜0.05。

表1 各组识别实验指数、穿环次数、游泳距离、潜伏期的对比（±s）

表1 各组识别实验指数、穿环次数、游泳距离、潜伏期的对比（±s）

注：“*”表示与第1组相比，P＜0.05；“#”表示与第2组相比，P＜0.05。下同。

组别 识别指数/%穿环次数/次游泳距离/c m 潜伏期/s第1组（n=1 0） 5 3.2 2±5.4 9 1 1.2 3±3.5 2 2 3.3 7±5.6 8 3 4.3 3±5.4 2第2组（n=1 0） 1 3.5 4±9.0 2*4.6 8±1.6 7*7 3.6 5±9.6 7*8 7.6 5±6.3 2*第3组（n=1 0） 3 1.6 5±5.6 8#7.9 8±1.2 9#5 3.4 2±5.4 4#6 4.5 2±4.5 2#第4组（n=1 0） 3 3.9 6±6.9 8#8.0 3±1.7 4#5 0.6 8±5.6 4#4 4.6 8±3.7 1#

2.2 各组大鼠凋亡小脑神经细胞的情况

如图1所示，本文对各组动物海马区进行了组织形态学观察，发现与第1组相比，第2组大鼠海马CA1区细胞带排列紊乱、稀疏，出现神经元丢失、可见核固缩或溶解、细胞空泡以及胞体不规则等形态学改变。统计学数据分析显示，与第1组相比，第2组大鼠CA1区椎体细胞凋亡增多，神经元密度显著降低。与第2组相比，第3组大鼠神经元细胞排列整齐，边界清晰，神经元细胞数量显著增多；第4组神经元细胞排列更加整齐，凋亡的细胞与3组无明显差异。因此可以得出吗替麦考酚酯能够有效阻止神经细胞的凋亡。

图1 各组大鼠海马锥体神经元HE染色（Bar=50 μm）

2.3 各组大鼠海马自噬蛋白Beclin-1与LC3的表达

由表2可知，与第1组相比较，第2组大鼠海马自噬蛋白Beclin-1与LC3的表达显著下降（P＜0.05）；与第2组相比较，第3组、第4组大鼠海马自噬蛋白Beclin-1与LC3的表达显著上升（P＜0.05）。表明吗替麦考酚酯能够有效抑制小胶质细胞活性，并且其活性与Beclin-1与LC3的表达呈现负相关[8]。

表2 各组大鼠海马自噬蛋白Beclin-1与LC3的表达（±s）

表2 各组大鼠海马自噬蛋白Beclin-1与LC3的表达（±s）

组别 Beclin-1 LC3第1组（n=10） 0.88±0.12 0.69±0.11第2组（n=10） 0.21±0.04* 0.31±0.08*第3组（n=10） 0.66±0.08# 0.64±0.07#第4组（n=10） 0.73±0.11# 0.69±0.12#

3 讨论

阿尔茨海默病神经病理的特点之一为大脑出现显著Aβ蛋白沉积，并且Aβ蛋白的积聚程度和阿尔茨海默病病情程度相关。当阿尔茨海默病的患者或者阿尔茨海默病的动物模型出现脑组织中Beclin蛋白中Beclin-1基因下降，Beclin-1蛋白表达出现缺失，导致自噬水平降低，自噬体减少，Aβ蛋白生成但未被降解，出现异常的沉积，最终会形成阿尔茨海默病。吗替麦考酚酯属于免疫抑制剂中最为典型的药物，使用吗替麦考酚酯能够有效掌控阿尔茨海默病的病情发展[9]。自噬属于存在真核细胞内细胞代谢的现象，可保持细胞内代谢环境的稳定，但自噬损伤或者自噬过度对细胞的功能产生影响。自噬具有能够调节细胞生存、代谢、生长、死亡及神经保护性、退行性作用的重要生物学功能[9]。LC3是自噬泡内膜中的自噬调节蛋白，细胞自噬时LC3被加工并溶于细胞质，LC3-Ⅰ型与自噬泡膜的磷脂酰乙醇胺合并形成LC3-Ⅱ，发挥调节的功能，所以LC3蛋白的表达能够直观显示细胞的自噬活性。

本研究运用识别实验、水迷宫实验检测阿尔茨海默病大鼠学习认知能力。研究实验中，吗替麦考酚酯能够缓解神经元细胞的死亡，可提高自噬的活性，能够有效降低小胶质细胞活性，其机制与强化自噬水平及增强Beclin-1与LC3的表达有关。

综上所述，吗替麦考酚酯能够有效改善阿尔茨海默病大鼠学习认知的能力，对于治疗阿尔茨海默病有较好的疗效。