大鼠过敏性猝死中HK-1的表达研究

薛超，刘东璞,2，盛延良,2，吕婷，卢凤美,2*

（1.佳木斯大学 基础医学院，黑龙江佳木斯 154000；2.黑龙江省微生态-免疫调节网络与相关疾病重点实验室，黑龙江佳木斯 154000）

近年来，过敏性疾病发病率明显增高，已成为严重影响人们身体健康和生活质量的全球性疾病。流行病学调查资料表明，目前我国的过敏性疾病发病率有不断上升的趋势[1-2]。由于过敏性猝死发病急骤，难以预见，极易引起医疗纠纷等一系列法律问题[3]。因此，与过敏反应有关的死亡引起了法医学家尤其是法医病理学家关注[4]。当前过敏性疾病死亡的法医学诊断仍是在排除其他疾病的基础上结合死者的病史、组织病理学观察和生物化学指标检测等做出诊断。因此，找到过敏性疾病死亡的特异性诊断指标成为了近年来法医学的热门研究方向。

HK-1是近年来发现的一种新型神经肽，属于速激肽家族。HK-1的相关作用首先在B淋巴细胞内得到证实[5]。而典型的速激肽受体有NI1R、NK2R和NK3R，研究表明HK-1明显偏好于NK1R[6]。在哺乳动物中，速激肽家族广泛分布在各种组织和体液中，包括肺脏和胃肠组织的间质成分中[7]。最近的研究发现，在重度过敏性疾病的肥大细胞脱颗粒通路中存在一个HK-1/NK1R自分泌通路，可达到增强致敏持续性的效果，和严重的过敏性休克及猝死关系密切[8]。

为了探究HK-1在过敏性猝死中的表达及表达稳定性、分析不同保存环境对尸体中相关指标的干扰程度，在卵蛋白（Ovalbumin，OVA）致大鼠过敏性猝死模型的基础上，对各指标进行ELISA和qRTPCR检测，以期在蛋白表达方面和mRNA表达方面对HK-1的表达进行全面系统的检测，为过敏性疾病的法医学诊断提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型建立

健康SD雄性大鼠50只（由佳木斯大学动物实验中心提供），体质量（250±10）g，适应性饲养1周，随机分为实验组和对照组，实验组40只，对照组10只。实验组再次随机分为0 h死亡组（10只）、24 h常温组（10只）、48 h冷藏组（10只）、7 d冷冻组（10只）[9]。

实验组按体重给予过敏原，每100 g体重给予10 mg卵蛋白（溶于0.5 mL生理盐水，弗氏完全佐剂1∶1混合），分别于第1、3、5、7天腹腔注射给药1次，用以增强致敏效果，第18天尾静脉注射110%卵蛋白3 mL[10]。对照组按体重给予生理盐水，每100 g体重给予0.5 mL生理盐水，分别于第1、3、5、7天腹腔注射生理盐水1次，第18天尾静脉注射3 mL生理盐水，乙醚吸入麻醉后断颈处死。本研究通过佳木斯大学动物伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器

鸡卵蛋白和弗氏完全佐剂，美国Sigma-Aldrich公司；大鼠酶联免疫分析试剂盒（SP、HK-1、NK1R），上海劲马实验设备有限公司；Total RNA提取试剂（TRIzol），美国Invitrogen公司；反转录试剂盒和qRT-PCR反应体系，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；苏木素，上海蓝季科技发展有限公司；伊红溶液，天津市光复精细化工研究所。

FA2104A型电子天平，上海精天电子仪器有限公司；EG1160智能包埋机，中国科学器材进口总公司；RM2235型切片机，德国Leica公司；TEC-2800-C摊片机，郝恩琳（常州）医用仪器有限公司；TProfessional Thermocycler PCR仪，德国Biometra公司；LightCycler 480 Ⅱ荧光定量PCR仪，美国Roche公司；CX23LEDRFS1C型生物显微镜，奥林巴斯（广州）工业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HE染色

各组肺部和胃肠组织固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后进行常规HE染色，光学显微镜下观察。

1.3.2 ELISA法

标准品按照ELISA试剂盒说明书配制，提取肺部和胃肠组织研磨后提取组织液，稀释加样后温育加酶并显色，并以空白孔为参照，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据标准曲线计算样品物质浓度。标准曲线方程为Y=-0.175 0+145.813 8X，R2=0.996 8。

1.3.3 qRT-PCR法

按照说明书提取肺部和胃肠组织总RNA，之后将RNA反转录成cDNA。再用荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并采用2-△△CT法对HK-1的相对含量进行定量分析。引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR反应的引物设计

1.4 统计学分析

应用SPSS 16.0软件和GraphPad Prism 9软件进行统计分析。数据用平均值±标准差表示，各组间的比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果与分析

2.1 动物建模观察

对照组尾静脉注射生理盐水后无明显变化。实验组尾静脉注射OVA溶液后，大鼠先是叫声尖利，后出现躁动，呼吸急促，随后抽搐，最后趴伏，约60 min内死亡[11]。

2.2 组织学观察

切片进行HE染色后，显微镜下观察，各组织HE染色结果如图1所示。

图1 大鼠肺部和胃肠组织HE染色组织学观察（×400）

实验组大鼠可见喉头、气管黏膜水肿，黏膜下层可见嗜酸性粒细胞浸润。肺泡壁间隔增宽，且部分肺泡壁破裂，间质毛细血管内淤积大量红细胞，且有炎症细胞渗出至肺泡腔内。肺泡腔有少许均质粉染的水肿液和纤维渗出。肺泡壁间质内有大量中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润（图1A～图1E）。胃肠壁淤血，胃肠黏膜间质血管扩张充血且腺体细胞和血管周围有大量中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润。7 d冷冻组组织自溶严重，但亦可见炎性细胞浸润。对照组除了可见不同程度组织自溶外，其余均正常（图1F～图1J）。这说明实验组大鼠有明显的过敏性病理组织学症状的表现，本实验OVA致大鼠过敏性猝死模型建造成功。

2.3 ELISA结果

由表2可知，与对照组相比，各实验组肺部和胃肠组织中HK-1蛋白相对表达量均增高，且0 h死亡组、24 h常温组、48 h冷藏组表达量显著升高（P＜0.05），但3个处理组间差异不显著（P＞0.05）；7 d冷冻组表达量与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。ELISA结果表明，长时间的冷冻后解冻和反复冻融导致的尸体腐败和组织自溶可能对HK-1蛋白的检测有一定的影响。

表2 大鼠肺部及胃肠组织HK-1的ELISA检测结果（单位：pg/mL）

2.4 qRT-PCR结果

由表3可知，与对照组相比，7 d冷冻组的肺部和胃肠组织中HK-1 mRNA的相对表达量没有显著变化（P＞0.05）；0 h死亡组、24 h常温组和48 h冷藏组肺部组织中HK-1 mRNA相对表达量显著高于对照组（P＜0.05），且随着保藏时间的延长而下降，各处理组间差异显著（P＜0.05）；0 h死亡组、24 h常温组和48 h冷藏组胃肠组织中HK-1 mRNA相对表达量显著高于对照组（P＜0.05），且随着保藏时间的延长而先上升后下降，各处理组间差异显著（P＜0.05）。qRT-PCR结果说明，长时间的冷冻后解冻和反复冻融导致的尸体腐败和组织自溶对HK-1mRNA的检测有一定的影响。

表3 大鼠肺部及胃肠组织HK-1 mRNA相对表达量水平

3 结论

通过对HK-1在大鼠过敏性猝死时肺部和胃肠组织中的实验性研究，观察其在不同时间和储存条件下的表达和变化情况，从而判断其在过敏性猝死中的法医学诊断意义和价值。结果表明，过敏性猝死大鼠肺部和胃肠组织0 h死亡组、24 h常温组、48 h冷藏组中HK-1蛋白和mRNA的表达水平均高于正常对照组，7 d冷冻组与对照组差别不明显。说明过长时间冷冻及解冻尸体可降低HK-1的表达，可为过敏性猝死48 h内的法医学鉴定提供一定的参考价值，但缺乏一定的定量结果，故对长时间冷冻尸体的过敏性猝死的法医学鉴定仍需进一步的研究和探索。