丹参酮提取物的急性毒性及抗炎试验研究

陶蕾，王广宇，王明彦，陈彦亮，樊志强

（1.兰州市职业技术学院，甘肃兰州 730070；2.三门峡广宇生物制药有限公司，河南三门峡 472400；3.河南省中药材生产技术推广中心，河南郑州 450000）

从丹参中提出丹参酮，主要成分包括丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ A、丹参酮Ⅱ B、隐丹参酮以及异隐丹参酮等十多个丹参酮个体，丹参酮具有清除氧自由基、抑制炎症细胞增殖、抗菌等作用。前期体外抑菌研究结果显示，丹参酮对金黄色葡萄球菌有显著的抑制作用。丹参酮不仅具有广谱抗菌作用，还有类雌激素活性和抗雄激素效应，可以减少白细胞的氧自由基释放，抑制白细胞介素-4、白细胞介素-6、内皮素以及肿瘤坏死因子α等不同炎性因子的释放，降低血前列腺素F2a与前列腺素E水平，降低免疫复合物所诱发的炎症反应[1]。奶牛乳房炎是由于乳腺在化学、物理、微生物等因素刺激下而导致奶牛乳房的炎症，可分为临床型、亚临床型和非临床型乳房炎，是奶牛较为常见的一种多发病。据统计，全球2亿多头奶牛中约有30%的奶牛患有各类乳房炎疾病，带来的经济损失可达300亿人民币，严重威胁奶牛养殖业的健康发展[2]。目前，奶牛乳房炎主要通过注射抗菌药物以及乳房灌注治疗，抗感染药物作用迅速，针对性强，但存在易产生耐药性和兽药残留的问题[3]。丹参酮具有低残留、不易产生耐药性的特点，具有广阔的发展前景。本文旨在通过评价其毒性及抗炎作用，为进一步临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丹参酮提取物，隐丹参酮含量为3%；丹参酮ⅡA含量为11%；大豆油，食品级，山东鲁花集团有限公司；角叉菜胶，食品级，山东滕望化工有限公司。

氢化可的松注射液（2 mL×10支/盒），三门峡广宇生物制药有限公司；青霉素、磷酸地塞米松、伊文思蓝、二甲苯、冰醋酸、甲醇、氢氧化钾、乙醚，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Ml104/02电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；XT4000i血液细胞分析仪，日本SYSMEX公司；AU5800生化分析仪，贝克曼库尔特国际贸易（上海）有限公司；D-37520低温高速离心机，美国Thermo scientific公司。

1.3 实验动物

昆明小鼠，雌雄各半，体重18～22 g，购于兰州大学实验动物中心。

1.4 实验方法

1.4.1 急性毒性试验（LD50）

将60只小鼠雌雄各半分成6组，一组为对照组，余下5组分别按2 060 mg/kg、2 580 mg/kg、3 230 mg/kg、4 040 mg/kg和5 050 mg/kg体重给药，实验药品均用大豆油溶解，对照组给予大豆油灌胃，剂量为5 000 mg/kg体重，观察48 h小鼠的死亡情况。

1.4.2 丹参酮提取物的抗炎试验

1.4.2.1 耳发炎肿胀模型

将60只昆明小鼠雌雄各半分为3组，第一组丹参酮提取物腹腔注射，给药剂量为425 mg/kg；第二组氢化可的松注射，给药剂量为420 mg/kg。每日对小鼠注射丹参提取物1次，持续4 d；模型组给予同样体积的生理盐水。在小鼠右耳两面涂抹二甲苯，致炎1 h后处死，沿耳廓基线剪下双耳，用直径为9 mm的打孔器在左、右耳相对称部位取下耳片称重，计算耳廓肿胀度[4]。耳廓肿胀度=右耳廓重-左耳廓重。

1.4.2.2 小鼠毛细血管通透性试验

与1.4.2.1给药相同，将60只昆明小鼠雌雄各半分成3组，将仅注射生理盐水的模型组作为对照组，与其他用药组（两组）进行对比。所有小鼠进行最后一次给药后，观察其基本特征，确定无异样后于小鼠尾部静脉注射伊文思兰溶液（0.2 mL/只），同时注射0.7%冰醋酸溶液（0.1 mL/10 g）使其出现炎症反应。确定炎症反应，观察20 min后处死并打开腹腔，使用不超过4 mL的生理盐水对腹腔进行冲洗并收集冲洗液，常规离心后静置30 min取上清液采用紫外光度计测定OD值，并进一步计算小鼠腹中的伊文思兰和成分占比[5]。

1.4.2.3 小鼠足跖肿胀及前列腺素E2（PEG2）渗出试验

将60只昆明小鼠雌雄各半分为3组，在最后一次给药结束后观察30 min，确定所有小鼠无异样后于每只小鼠右后足足趾部位进行皮下注射，致炎药物使用1%角叉菜胶0.03 mL（0.024 1 g）。4 h后处死小鼠，切下左右后足并精确测量其重量，通过对比左右两侧后足重量计算足趾肿胀率，足趾肿胀率（%）=（右后足重-左后足重-致炎剂）/左后足重。后将发生炎症反应的右足剥除表皮，并置于2.5 mL的生理盐水中维持2 h以上，常规离心后静置30 min，将上清液分离后取少量样本（0.5 mL）与甲醇溶液（2 mL 0.5 mol/L KOH）混合水浴，在相同温度条件下维持20 min，使其异构化。后置于甲醇溶液中，待总量升至5 mL时在紫外光度计下测量OD值，以表示溶液中PEG2含量[6]。

1.4.2.4 小鼠纸片肉芽肿试验

将40只昆明小鼠雌雄各半分为两组，在无菌操作下对所有小鼠进行滤纸片移植手术，滤纸具有青霉素活性，在手术结束后第2 d给药，模型组灌服等体积的生理盐水，另一组小鼠灌服丹参提取液18 d。于最后一次给药结束1 h后处死昆明小鼠，取出肩胛部皮下滤纸片，并取周边少量肉芽组织，常规干燥处理后，使用天平称量组织并计算增长肉芽组织重量，为保证数据准确，测量数据应统计3次以上[7]。

1.5 统计分析

本试验用SPSS23.0进行统计学分析，在数据资料符合正态分布的情况下，采用均数±标准差表示，组间应用独立样本t检验统计分析，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验（LD50）结果分析

通过口服给药后，各组小鼠在出现短暂安静和卷缩身体后转为正常，在最大给药剂量为5 050 mg/kg时，小鼠未出现死亡。根据毒性试验判定标准，当最大给药剂量为5 000 mg/kg，为无毒物质，故可以证明丹参酮提取物无毒，可以应用于临床[8]。

2.2 丹参酮提取物对小鼠耳肿胀的影响

由表1可知，丹参酮提取物的抗炎实验表明每天腹腔注射425 mg/kg丹参酮提取物可以有效控制二甲苯诱导的昆明小鼠耳肿胀，与摄入生理盐水的模型组相比，存在显著差异（P＜0.01）；丹参酮提取物组昆明小鼠鼠耳肿胀的肿胀率高于氢化可的松组。

表1 丹参酮提取物对昆明小鼠耳肿胀的影响

2.3 丹参酮提取物对小鼠毛细血管通透性的影响

由表2可知，丹参酮提取物组与模型组相比，存在显著差异（P＜0.01），表明对小鼠应用丹参酮提取物可显著减少染料的渗出量，且丹参酮组与氢化可的松组无显著差异。

表2 丹参酮提取物对昆明小鼠腹腔毛细血管通透性影响

2.4 丹参酮提取物对小鼠足跖肿胀及（PEG2）渗出影响

丹参酮提取物对昆明小鼠足跖肿胀及（PEG2）渗出的试验结果表明，丹参酮提取物组与模型组相比，存在显著差异（P＜0.01），表明丹参酮提取物对发生炎症足中PEG2的渗出有显著抑制作用。丹参酮提取物组与氢化可的松组比较无显著差异，均能有效地抑制PEG2的渗出。详见表3。

表3 丹参提取物对昆明小鼠足跖肿胀及PEG2渗出的影响

2.5 丹参酮提取物对小鼠纸片肉芽肿的影响

由表4可知，丹参酮提取物组与仅使用生理盐水的模型组相比，具有显著差异（P＜0.01），表明丹参酮提取物在抗纸片引起的肉芽肿方面有明显的效果。

表4 丹参提取物对昆明小鼠纸片肉芽肿的影响

3 结论

由急性毒性实验结果可以得出，丹参酮提取物为无毒物质，可以应用于临床；通过丹参酮提取物对小鼠耳肿胀的影响试验表明丹参酮提取物组昆明小鼠鼠耳肿胀的肿胀率高于氢化可的松组；通过丹参酮提取物对小鼠毛细血管通透性的影响试验表明对小鼠应用丹参酮提取物可显著减少染料的渗出量，与氢化可的松无显著差异；通过丹参酮提取物对小鼠足跖肿胀及前列腺素E2（PEG2）渗出影响表明丹参酮提取物与氢化可的松均能有效地抑制PEG2的渗出；通过以上试验结果表明丹参酮提取物对急性炎症具有显著的临床效果；通过丹参酮提取物对小鼠纸片肉芽肿的影响表明丹参酮提取物在抗纸片引起的肉芽肿方面有明显的效果，丹参酮提取液能有效减少肉芽组织增生，对慢性炎症反应亦有明显的抗炎效果。以上试验结果显示参酮提取物对急性以及慢性炎症反应皆有较好的抑制作用，能够为进一步临床应用提供依据。