亚砷酸钠暴露对人甲状腺Nthyori 3-1细胞焦亡相关蛋白表达的影响

王大朋，王仁珞，范丽丽

（贵州医科大学 环境污染与疾病监控教育部重点实验室/公共卫生与健康学院，贵州贵阳 550025）

甲状腺是人体最大的内分泌器官，对机体的生长发育、新陈代谢等均有重要作用，其功能损伤与疾病发生发展密切相关。甲状腺疾病病因复杂，除年龄、性别、遗传等传统因素外，环境因素对其影响亦引起国内外研究人员广泛关注[1]。砷是一种环境类金属毒物，机体可通过呼吸道、食物和饮水摄入及皮肤吸收暴露于砷，可引起急、慢性砷中毒，导致多器官损伤[2]。近年来人群及动物研究发现，砷暴露与甲状腺疾病发生发展密切相关[3-5]。但该方面研究目前尚处于起步阶段，砷致甲状腺损伤具体类型及发病机制均未见相关报道。本研究拟在体外层面探讨砷暴露对人甲状腺细胞焦亡相关蛋白表达的影响，为砷致甲状腺损伤分子机制研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

正常人甲状腺细胞Nthyori3-1，中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 仪器与试剂

INCO2108型CO2培养箱，德国Memmert公司；PowerPac HC型蛋白电泳仪系统，美国Bio Rad公司；ChemiDocTMXRS+型凝胶成像系统，美国Bio Rad公司；Multiskan™ GO型多功能酶标仪，美国Thermo Fisher公司。

亚砷酸钠（NaAsO2），优级纯，美国Sigma-Aldrich公司；DMEM高糖培养基，细胞级，北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清（FBS），北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白一抗，上海爱必信生物科技有限公司；GAPDH蛋白一抗，美国ImmunoWay公司；羊抗鼠/羊抗兔二抗，上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 实验分组

Nthyori3-1细胞接种于含10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素和100 IU/mL青霉素的DMEM高糖培养基中，37 ℃、5%CO2条件下常规培养。取生长状态良好，且处于对数生长期的细胞按5×105个/孔密度接种于 6孔板，将NaAsO2以 0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L的浓度梯度进行染毒，处理24 h；另外以4 μmol/L的NaAsO2处理Nthyori3-1细胞0 h、12 h、24 h、48 h。

1.4 Western-blot法检测焦亡相关蛋白

到达各染毒终点收集细胞沉淀，RIPA裂解后16 000×g离心20 min，收集上清，采用BCA法测定蛋白浓度。按说明书依次进行制胶、蛋白上样（20 μg）、电泳、转膜、封闭，将相应蛋白一抗进行4 ℃孵育过夜后，TBST洗膜，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育90 min，ECL化学发光法进行显影，Image J软件进行灰度值分析。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。所有数据符合正态分布，且具有方差齐性，数据均采用均值±标准差表示。采用单因素方差分析进行多组间比较，两两比较采用LSD法。检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同剂量NaAsO2对焦亡相关蛋白表达水平的影响

如图1所示，随着NaAsO2处理浓度的增加，Nthyori3-1细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平均逐渐升高，其中NLRP3、GSDMD蛋白表达呈明显剂量-反应关系（P＜0.05）。

图1 不同剂量NaAsO2对Nthyori3-1细胞焦亡相关蛋白表达水平的影响

2.2 NaAsO2暴露不同时间对焦亡相关蛋白表达水平的影响

如图2所示，与对照组相比，NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平随染毒时间的延长均呈现明显增加趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。与12 h组相比，染毒24 h、48 h的NLRP3、GSDMD表达显著上升（P＜0.05）。NLRP3在染毒48 h后的表达水平较24 h明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 NaAsO2暴露不同时间对Nthyori3-1细胞焦亡相关蛋白表达水平的影响

3 结论

人群流行病学和有限的动物实验均发现砷暴露可对甲状腺及其功能造成不同程度的损伤[3-6]。然而，砷暴露对体外人甲状腺细胞的毒性作用目前未见相关报道。本研究以Nthyori3-1细胞为研究对象，探讨砷暴露对其毒性作用及可能机制。

细胞焦亡是近年来新发现的一种促炎性、程序性细胞死亡方式，由GSDMD分子被NLRP3炎症小体剪切活化后在细胞膜上形成孔洞而导致其完整性破坏，释放其细胞内容物以及白介素等促炎物质，引发炎症级联反应，进而造成细胞损伤[6]。炎症小体主要由NLRP3、ASC及Caspase-1前体（pro-Caspase-1）组成。在内源性或外源性物质刺激下，活化的Caspase-1能够特异性切割GSDMD，使其生成C端和N端，GSDMD的N端与细胞膜上的磷脂结合，使细胞膜形成许多小孔，细胞的完整性遭到破坏，导致细胞肿胀、破裂，释放细胞内的炎性物质，从而诱导细胞焦亡的发生[7]。

近年来，有限的研究发现砷可诱导不同细胞发生焦亡。LI等[8]用NaAsO2处理人肝L-02细胞，观察发现IL-1β和活化的Caspase-1水平随着染砷剂量的增加而增加。用NaAsO2处理肝癌细胞可以诱导其发生细胞焦亡[9]。另有研究发现，长期接触NaAsO2可诱导TNF-α的产生，进而引起NLRP3介导的炎性细胞活化，诱导胰腺细胞发生细胞焦亡[10]。但是，砷对甲状腺细胞焦亡的影响目前尚不清楚。本研究以人正常甲状腺Nthyori 3-1细胞为研究对象，首次探讨了不同浓度砷暴露不同时间对其焦亡相关蛋白表达的影响，结果显示NaAsO2染毒Nthyori 3-1细胞后，其细胞内的NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达量较对照组均显著增加。

综上，本研究发现无机砷能够诱导甲状腺细胞焦亡相关蛋白表达水平升高，进而可能引起甲状腺细胞焦亡，具体机制有待进一步深入研究。