野樱莓中绿原酸提取工艺研究

2022-11-24张高博谢承乾陈晓敏

生物化工 2022年5期

张高博，谢承乾，陈晓敏

（武汉华夏理工学院，湖北武汉 430223）

野樱莓，学名黑果腺肋花楸，蔷薇科腺肋花楸属[1]，其果实富含蛋白质、糖类、有机酸、微量元素和多酚类物质等，其中黄酮、花青素、原花青素、酚酸等多酚类物质是其主要的抗氧化成分，对自由基有很强的清除作用[2]。绿原酸是野樱莓多酚类物质的主要成分[3]，具有抗菌、抗病毒、保肝利胆的功效，在医药、食品等领域得到了广泛的应用[4]。目前，国内有关野樱莓中绿原酸的研究以及绿原酸的测定方法较少，主要为溶剂提取法、超声波辅助提取法和超临界萃取法等，提取方法多集中于优化单一提取工艺[5]。本文采用酶-超声联合提取法，通过单因素实验和正交试验确定提取野樱莓中绿原酸的最佳工艺，摸索野樱莓中绿原酸含量测定的方法，为提高野樱莓的经济价值、扩大其应用范围提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

野樱莓果干（市售，产地为辽宁丹东）；乙醇、盐酸、氢氧化钠、硫酸亚铁、氯化铁、三水合乙酸钠、过硫酸钾，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；DPPH粉末、ABTS粉末、TPTZ粉末，合肥巴斯夫生物科技有限公司；绿原酸对照品（98.5%），上海如吉生物科技发展有限公司；β-糖苷水解酶，实验室自制。

TU-1900紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；FA2004N电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司；PHS-25 pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；BILON10-300A超声波清洗器，上海比朗仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 野樱莓绿原酸的提取工艺

提取工艺流程：称取0.12 g β-糖苷酶溶解于80 mL pH 5.0的70%乙醇溶液中，30 ℃条件下活化10 min；加入4 g野樱莓果干，50 ℃冷凝回流提取60 min，超声提取25 min，冷却过滤，滤液定容至250 mL，即得绿原酸提取液。

1.2.2 野樱莓绿原酸含量测定

（1）最大吸收峰确定

取一定量绿原酸标准品溶液，采用紫外可见分光光度计在200～600 nm进行全波长扫描，确定绿原酸的最大吸收波长。

（2）绿原酸标准曲线绘制

称取绿原酸标准品5 mg，70%乙醇定容至10 mL作为母液，倍比稀释。在最大吸收波长处测定不同浓度标准品的吸光度（A）值，以绿原酸浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

（3）绿原酸含量测定

取一定量粗提液，倍比稀释，使其吸光度在0.2～0.8。在最大吸收波长处测定样品吸光度，根据标准曲线的回归方程求出提取液中的绿原酸质量浓度（mg/mL）。

（4）绿原酸提取率计算

绿原酸提取率按公式（1）计算。

式中：V为提取液定容体积，mL；C为绿原酸浓度，mg/mL；D为提取液稀释倍数；M为野樱莓果实质量，g。

1.2.3 野樱莓绿原酸抗氧化活性测定

（1）ABTS自由基清除能力

取100 μL绿原酸提取液和100 μL无水乙醇分别与3.9 mL ABTS试剂混合，避光反应10 min，测定混合液在734 nm处的吸光值，分别记为A1和A2。按照式（2）计算自由基清除率。

（2）DPPH自由基清除能力

将2 mL绿原酸提取液和2 mL DPPH试剂混合，2 mL绿原酸提取液和2 mL蒸馏水混合，2 mL蒸馏水和2 mL DPPH试剂混合，避光反应30 min，测定在517 nm处的吸光值，分别记为A3、A4和A5。按照式（3）计算自由基清除率。

（3）FRAP自由基清除能力

使用浓度0.1～0.8 mmol/L的硫酸亚铁溶液代替野樱莓绿原酸试样绘制FRAP标准曲线。线性回归方程为y=2.941 7x+0.124 3，R2=0.999 7。

取野樱莓绿原酸提取液100 μL于试管中，加入FRAP试剂2.4 mL，测定在593 nm处的吸光值，根据FRAP标准曲线的回归方程求出所提取绿原酸的FRAP值。

（4）计算综合抗氧化活性

将ABTS、DPPH、FRAP 3种抗氧化性检测所得结果取平均值，即为该绿原酸提取液的综合抗氧化活性。

1.2.4 单因素试验设计

称取4 g野樱莓果干，用酶-超声联合提取法提取绿原酸，通过改变溶剂pH（3～7）、溶剂体积分数（50%～90%）、料液比（1∶10～1∶50，g∶mL）、酶的用量（1%～5%）、冷凝回流时间（40～80 min）、提取温度（50～90 ℃）和超声提取时间（5～45 min）7个影响因素，进行单因素实验，并测定绿原酸提取率和抗氧化活性。每组单因素实验进行3组平行实验，取其平均值。以绿原酸的提取率和抗氧化活性为指标，确定各因素的最适范围，优化提取工艺参数，并分析各因素对绿原酸提取率和抗氧化活性的影响。

1.2.5 正交试验

以野樱莓中绿原酸提取率和抗氧化活性为评价指标，依据单因素实验结果，筛选出提取温度、溶剂体积分数、冷凝回流时间3个主要因素，每个主要因素设置3个水平，设计3因素3水平正交试验。设计的正交试验各因素水平范围见表1，采用L9(34)正交表进行正交试验。

表1 正交试验因素及水平设计表

2 结果与分析

2.1 绿原酸含量测定

通过绿原酸光谱扫描曲线可以确定绿原酸的最大吸收波长为332 nm（图1a）。绿原酸在0.004～0.024 mg/mL与其吸光度值具有良好的线性关系，其线性回归方程为y=39.136x-0.017 7，R2=0.999 8（图1b）。

图1 绿原酸含量测定

2.2 单因素实验

单因素实验表明，乙醇体积分数（图2B）、冷凝回流时间（图2E）、提取温度（图2F）对绿原酸提取率和抗氧化活性的影响较大。这3项单因素的改变均能够在较大程度上提高绿原酸提取率和自由基清除率，且绿原酸提取率维持在较高水平。其中，通过乙醇体积分数的改变，绿原酸提取率从0.091 8%提高到0.199 4%；通过冷凝回流时间的改变，绿原酸提取率从0.116 8%提高到0.270 4%；通过提取温度的改变，绿原酸提取率从0.206 2%提高到0.956 4%。溶剂pH（图2A）、料液比（图2C）、酶的用量（图2D）对绿原酸提取率和自由基清除率的影响较小，曲线波动较为平缓；而超声提取时间（图2G）虽对绿原酸提取率有较为明显的影响，但提取率却始终处于一个较低的范围，且自由基清除率基本不受超声提取时间的影响，维持在一定的值，故不将这4项因素纳入正交实验设计。

图2 各因素对绿原酸提取率和抗氧化活性的影响

2.3 正交试验

提取温度、乙醇体积分数、冷凝回流时间为影响因素设计正交试验，以绿原酸提取率和综合抗氧化活性为评价指标，每组正交试验平行进行3次，取平均值。正交试验结果见表2。结果显示，通过极差R大小确定影响绿原酸提取率的因素主次顺序为提取温度＞冷凝回流时间＞乙醇体积分数；根据K值可知，最佳提取工艺为提取温度80 ℃、乙醇体积分数65%、冷凝回流时间90 min。进行3次验证性实验，测得绿原酸平均提取率为1.382 4%，可确定此工艺为最优提取工艺，且重复性好。