响应面法优化龙脑樟总黄酮提取工艺

吴静

（江西省科学院应用化学研究所，江西南昌 330096）

龙脑樟[Cinnamomum camphora(L.) Presl]为樟科（Lauraceae）樟属（Cinnamomum）常绿乔木，1987年首次在江西吉安发现，目前在江西吉安、湖南新晃两地有种植，资源较为稀缺[1]。因其精油中富含右旋龙脑（天然冰片），在中医典籍中将其划分为芳香开窍类药材，常用于通窍明目、解郁散火、祛风和中[2-8]。现代医学研究发现冰片具有抗炎镇痛、抗菌、增加血-脑脊液屏障及血脑屏障通透性、抗脑缺血、双向调节神经系统等功能[9]，因此常用于冠心病、动脉粥样硬化及心血管阻塞等心血管疾病的治疗。此外，研究表明龙脑樟中含有苯丙素类、萜类及黄酮类化合物等活性成分[10]。黄酮类化合物不能在人体内直接合成，广泛存在于自然界的植物中，属于植物的次生代谢产物，是一种天然的活性成分，具有抗菌杀虫、延缓衰老、缓解动脉粥样硬化、降血脂、降血压等功能[11-13]。本文针对龙脑樟黄酮类物质的提取工艺进行研究，为进一步提高龙脑樟资源的整体利用率提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦丁标准品，纯度≥98%，上海盈元化工有限公司；氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇，分析纯，天津市致远化学试剂股份有限公司。

龙脑樟由江西樟乡天然冰片有限责任公司提供，经江西省科学院应用化学研究所李雄辉研究员鉴定为龙脑樟，样本编号为PML202102。

1.2 仪器

2500A多功能粉碎机，永康市速锋工贸有限公司；KQ-500DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DLSB-10L/10低温冷却液循环泵，巩义市予华仪器有限责任公司；Infinite 200 PRO酶标仪，瑞士TECAN公司；ME204E电子天平，瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线绘制

准确称取芦丁标准品，用无水乙醇溶解，将芦丁标准品配置成浓度分别为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL、1.4 mg/mL、1.6 mg/mL和2.0 mg/mL的芦丁标准液。取芦丁标准液1 mL于比色管中，加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，避光反应5 min，之后依次加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液、2 mL 4%氢氧化钠溶液，静置反应15 min。于510 nm处测定吸光度，得到芦丁标准曲线。

1.3.2 龙脑樟黄酮提取

1.3.2.1 工艺流程

黄酮提取流程为样品→干燥粉碎（过20目筛）→石油醚脱脂→回收石油醚→乙醇超声提取→抽滤→浓缩→定容→龙脑樟黄酮提取液。

1.3.2.2 提取方法

准确称取1.00 g龙脑樟粉末，按1∶20（g∶mL）加入石油醚（60～90 ℃沸程），于50 ℃超声提取2次，超声功率500 W，每次30 min，去上清液。残渣于60 ℃烘箱中烘干。按照一定液料比加入乙醇溶液，超声波提取，重复提取3次，抽滤，合并滤液，真空减压浓缩，回收乙醇，定容至50 mL，获得龙脑樟黄酮提取原液。参照标准品显色方法，每组重复3次。按照公式（1）计算总黄酮提取量：

式中，P为待测样品黄酮提取量（以芦丁计），mg/g；C为代入标准曲线后得到的提取物样液的黄酮浓度，mg/mL；V为提取物样液体积，mL；N为稀释倍数；m为待测样品质量，g。

1.3.3 单因素实验

称取1.00 g干燥至恒重的龙脑樟粉末，分别考察乙醇体积分数、提取时间、溶剂量和提取温度对总黄酮提取量的影响。按方法1.3.2.2测其黄酮提取量，每组平行提取3次，获得各条件下最佳提取工艺条件。

（1）乙醇体积分数。固定溶剂量为20 mL/g，提取温度为50 ℃，提取时间为30 min，考察乙醇体积分数分别为30%、40%、50%、60%和70%对样品黄酮提取量的影响。

（2）提取时间。固定溶剂量为20 mL/g，提取温度为50 ℃，乙醇体积分数为50%，考察提取时间分别为10 min、15 min、20 min、25 min和30 min对样品黄酮提取量的影响。

（3）溶剂量。固定提取温度为50 ℃，乙醇体积分数为50%，提取时间为30 min，考察溶剂量分别为10 mL/g、20 mL/g、30 mL/g、40 mL/g 和 50 mL/g 对样品黄酮提取量的影响。

（4）提取温度。固定溶剂量为20 mL/g，提取时间为30 min，乙醇体积分数为50%，考察提取温度分别为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃对样品黄酮提取量的影响。

1.3.4 响应面实验设计

依据单因素实验确定的最佳工艺条件，针对（A）提取温度、（B）提取时间、（C）溶剂量和（D）乙醇体积分数，设计4因素3水平实验，见表1。以黄酮提取量为响应值，通过数据分析获取最佳提取工艺条件。

表1 Box-Behnken实验设计的因素与水平

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

以芦丁浓度（X）和吸光度（Y）绘制标准曲线，回归方程为Y=1.827 5X+0.311 1（R2=0.996 4），在0.06～0.60 mg/mL内线性关系良好。

2.2 单因素实验

2.2.1 溶剂量

如图1所示，龙脑樟黄酮提取量随着溶剂体积增加呈上升趋势，这说明溶剂较多时，龙脑樟粉末与溶剂充分接触，在超声波辅助作用下黄酮类物质充分转移至溶剂。而溶剂量达到40 mL/g后，溶剂继续增加会使溶液中黄酮类物质含量下降，这可能是因为溶剂已经饱和，同时溶剂过多会使油脂类、糖类等黏性物质渗出，进一步影响溶液吸光度[14-15]。因此，确定40 mL/g为最佳溶剂量。

图1 不同溶剂量对黄酮提取量的影响

2.2.2 乙醇体积分数

如图2所示，龙脑樟黄酮提取量在乙醇体积分数不超过60%时随着乙醇体积分数的增大而增加，这可能是因为黄酮类化合物易溶于强极性溶剂。乙醇体积分数超过60%时，总黄酮提取量减小，可能是乙醇体积分数过高，使龙脑樟中色素、脂溶性物质等渗出，黄酮类化合物溶解度降低[16]。因此，最佳乙醇体积分数为60%。

图2 乙醇体积分数对黄酮提取量的影响

2.2.3 超声时间

由图3可知，龙脑樟黄酮提取量在超声时间10～20 min内随时间延长呈上升趋势，主要是因为超声波的机械振动、击碎和搅拌等功能，物质分子运动加快，细胞壁破裂，黄酮类物质与溶剂充分接触并溶解。超声时间超过20 min后，龙脑樟黄酮含量开始出现下降趋势，这主要是由于超声时间过长，植物细胞破碎，溶液黏度增加，扩散速率降低，影响黄酮类物质提取，同时超声处理时间延长使黄酮类化合物稳定性降低，黄酮类物质结构被破坏、分解[17]。因此，20 min为最佳超声时间。

图3 不同提取时间对黄酮提取量的影响

2.2.4 提取温度

如图4所示，提取温度30～50 ℃，总黄酮提取量随温度升高而增加，是因为温度升高导致分子热运动速度加快，黄酮类物质快速溶于溶剂中。提取温度达到50 ℃时，龙脑樟黄酮类化合物几乎完全浸出，溶剂达到饱和状态，温度继续升高无法溶解出更多黄酮类化合物；同时高温会破坏黄酮类物质的结构与稳定性，伴有大量的杂质溶出，黄酮提取量下降。因此，最佳提取温度为50 ℃。

图4 不同提取温度对黄酮提取量的影响

2.3 响应面实验

2.3.1 建立多元二次模型方程

4因素3水平Box-Behnken实验数据见表2。经数据分析，得到以龙脑樟黄酮提取量为响应值的多元回归方程（2）：

表2 Box-Behnken实验设计和数据结果

式中，Y为总黄酮含量，mg/g；A为提取温度，℃；B为超声时间，min；C为溶剂量，mL/g；D为乙醇体积分数，%。

模型方差分析结果见表3，模型P=0.019 8＜0.05，表明该实验方法的实验结果可信；失拟项P=0.872 2＞0.05，表明可用该数学模型推测试验结果；R2adj=0.918 6表明有91.86%的情况可以用此方程解释。A、AB、BD和A2对黄酮提取量的影响显著（P＜0.05），D和D2对黄酮提取量的影响极显著（P＜0.01），而B、C、AC、AD、BC、CD、B2和C2的影响不显著（P＞0.05）。

表3 回归方程模型的方差分析

2.3.2 响应面交互作用分析

如图6所示，提取温度和超声时间的交互作用显著。将溶剂量和乙醇体积分数固定在0水平，提取温度不断升高，黄酮提取量呈现先增加后减少趋势，当提取温度达到57 ℃时，黄酮提取量达到最高。而对于超声时间，分三段讨论：提取温度在40～50 ℃时，超声时间越长，黄酮提取量越高；提取温度在50～55 ℃时，超声时间延长，黄酮提取量先增加后减少；提取温度在55～60 ℃时，超声时间越长，黄酮提取量减小。

图6 提取温度和超声时间交互作用对黄酮提取量的影响

由图7可知，提取温度和溶剂量交互作用对龙脑樟黄酮提取量的影响不显著。将超声时间和乙醇体积分数固定在0水平，黄酮提取量随温度的升高先增大后减小，黄酮提取量最大时，提取温度为54 ℃。随着单位物料加入溶剂体积的增加，黄酮提取量先增加后减小，溶剂体积达到45 mL/g时，龙脑樟黄酮提取量最大。

图7 提取温度和溶剂量交互作用对黄酮提取量的影响

如图8所示，提取温度与乙醇体积分数交互作用对黄酮提取量的影响不显著。将超声时间和溶剂量固定在0水平，提取温度升高，龙脑樟黄酮提取量先增加后减小，提取温度54 ℃时，黄酮提取量达到最高值。乙醇体积分数增加，黄酮提取量呈现先增加后减小趋势，乙醇体积分数达到58%时，黄酮提取量最大。

图8 提取温度和乙醇体积分数交互作用对黄酮提取量的影响

观察图9可知，超声时间与溶剂量交互作用对黄酮提取量影响不显著。将提取温度和乙醇体积分数定在0水平，可以得出，随着超声时间的延长和溶剂量的增加，黄酮提取量均表现为先增加后减小的趋势。超声时间为21 min，溶剂量为41 mL/g，黄酮提取量最大。

图9 超声时间和溶剂量交互作用对黄酮提取量的影响

由图10可知，超声时间和溶剂量对黄酮提取量影响显著。当提取温度和溶剂量处在0水平时，乙醇体积分数在50%～53%，随着超声时间延长，龙脑樟黄酮提取量不断减小；而乙醇体积分数在62%～70%，随着超声时间延长，黄酮提取量先增大后减小。超声时间在15～19 min，乙醇体积分数越大，黄酮提取量先增大后减小；超声时间在19～35 min，龙脑樟黄酮提取量随乙醇体积分数增大而不断减小。

图10 超声时间和乙醇体积分数交互作用对黄酮提取量的影响

如图11所示，溶剂量与乙醇体积分数的交互作用对黄酮提取量的影响不显著。将提取温度和超声时间固定在0水平，随着溶剂量的不断增大，龙脑樟黄酮提取量先增大后减小，当黄酮提取量最大时，溶剂量为42 mL/g。乙醇体积分数不断增大，黄酮提取量也呈先增大后减小趋势，黄酮提取量最大时，乙醇体积分数为58%。

图11 溶剂量和乙醇体积分数交互作用对黄酮提取量的影响

综合图6～图11结果可知，提取温度与超声提取时间，超声提取时间与乙醇体积分数的交互作用对龙脑樟黄酮提取量影响显著，观察曲面图的陡峭程度并结合P值，4个因素对龙脑樟黄酮提取量的影响顺序为乙醇体积分数＞提取温度＞溶剂量＞超声时间。

2.3.3 回归模型验证

综上所述，得出的最佳提取条件为提取温度60.00 ℃，超声提取时间15.00 min，溶剂量45.84 mL/g，乙醇体积分数50.03%。设计验证实验的条件为乙醇体积分数50%，溶剂量46 mL/g，超声提取时间15 min，提取温度60 ℃，重复提取3次，黄酮提取量分别为160.82 mg/g、161.23 mg/g、160.75 mg/g， 均 值 为160.93 mg/g。系统得出的理论值为161.86 mg/g，实验值接近理论值，该模型可较好地预测龙脑樟黄酮类物质的提取情况。

3 结论

本研究以乙醇为溶剂，采用响应面法优化超声提取龙脑樟黄酮工艺。龙脑樟黄酮最优提取条件为提取温度60 ℃、超声提取时间15 min、溶剂量46 mL/g、乙醇体积分数50%，预测黄酮提取量为161.86 mg/g。经实验验证，得出的实际黄酮提取量平均值为160.93 mg/g，与预测值相符，表明该提取条件可行。本研究可为龙脑樟黄酮类物质的开发利用提供理论支持，进一步提高龙脑樟的综合利用价值。