玉米醇溶蛋白/多糖基复合抗菌膜的制备及性能表征

王欣卉， 程 红， 陈佳鹏， 王韵仪， 任 健， 宋春丽， 宋雪健

(齐齐哈尔大学食品与生物工程学院1，齐齐哈尔 161006) (黑龙江八一农垦大学食品学院2，大庆 163319)

玉米黄粉是利用玉米在酿酒、制备淀粉糖等精深加工过程中产生的富含蛋白质废料，目前，常将含有60%蛋白质的玉米黄粉作为动物饲料的，导致其应用附加值极低[1]。玉米黄粉中的50%～70%的蛋白质为Zein，它是多种蛋白组成的混合物，平均分子质量为25～45 ku，主要包括α-玉米醇溶蛋白、β-玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白及δ-玉米醇溶蛋白，其中α-玉米醇溶蛋白占比75%～85%，易溶于95%的乙醇；β-玉米醇溶蛋白占比10%～15%，易溶于60%的乙醇，其余2种蛋白含量相对较低[2]。Zein作为食品药品监督管理局(FDA)认定的食品加工原料，其分子间的二硫键和疏水性氨基酸构成的复合结构，具有良好的生物相容性、可降解、溶解性及成膜性[3]。因此，Zein多被应用于医疗、食品、包埋等领域[4-6]。目前玉米醇溶蛋白的制备工艺主要有冷冻沉淀技术、凝胶色谱法、超临界CO2萃取技术、膜分离技术等[7]。

玉米醇溶蛋白因其无毒无害、透明、阻油、防紫外线、不需要交联剂可以单独成膜，是理想的绿色环保包装材料，但是以单一成分制备的玉米醇溶蛋白膜，脆性和稳定性价差。因此，对玉米醇溶蛋白膜的改性研究极为重要。甘油等低分子质量增塑剂能够在一定程度上降低玉米醇溶蛋白膜中聚合物分子间的作用力，进而增加膜的柔韧性，改善膜的易脆性[8]。多糖类物质因其容易获取，结构稳定，易于成膜等优点而常被应用于复合膜的改性研究中。将玉米醇溶蛋白和壳聚糖进行复合制备的薄膜具有较好的阻隔性和力学性能，玉米醇溶蛋白还可以改善明胶膜的延展性[9,10]。黄煜凯[11]研究发现随壳聚糖浓度的增大Zein/壳聚糖复合膜的水蒸气透过率呈现先减小后增大的趋势。在壳聚糖质量分数为3.5%时，复合膜的水蒸气透过率达到最低值，因此可以根据壳聚糖的浓度来改良玉米醇溶蛋白膜水蒸气透过性。王大鹏等[12]研究发现随着明胶浓度的增加，Zein/明胶纳米纤维的直径的增加显着增加。进而说明了利用明胶对Zein进行改性后的复合膜在生物活性传递及对抗菌剂的控释方面具有潜在的应用前景。

天然生物抗菌剂纳他霉素(Natamycin)和乳酸链球菌素(Nisin)具有高效、广谱、安全的抑菌功能，被广泛应用于抗菌膜的研究中。Mo等[13]制备了负载纳他霉素的玉米醇溶蛋白/酪蛋白复合纳米颗粒，并将其加入明胶膜中，以改善膜的物理化学和抗真菌性能，结果发现，该抗菌膜对黑曲霉、灰霉病菌和桔青霉具有较强的抗真菌活性。Hager等[14]将Nisin添加到Zein中制备成涂膜液，对鱼片进行保鲜研究发现，在保藏期内该方法可以有效地减低鱼片中李斯特菌的滋生。纳他霉素对真菌具有一定的抑制作用，但对细菌并无抑菌效果，而Nisin对细菌(革兰氏阳性菌)具有应的高效的抑制效果，而导致食品腐败变质的微生物包括细菌和真菌，因此对其共同抑制来延长食品的货架期极为重要。因此，研究采用玉米醇溶蛋白作为主要的成膜基材，通过与多糖类物质琼脂和卡拉胶进行复配，并将天然生物抗菌剂纳他霉素和Nisin作为抗菌剂来制备绿色环保抗菌包装材料，有利于拓宽玉米醇溶蛋白的开发与利用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

玉米醇溶蛋白粉(含蛋白质92.3%)、琼脂、卡拉胶、甘油、纳他霉素、乳酸链球菌素、氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾、无籽葡萄。

1.2 实验设备

XLW型智能电子拉力试验机， BYT-B1型透气性测试仪，TSY-T1H透湿性测试仪， THZ-82A水浴恒温振荡器， LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器，CR-400/410色彩色差仪， DMN型光泽度仪， WGT-S透光率/雾度测定仪， 2WAJ阿贝折射仪。

1.3 复合抗菌膜的制备

玉米醇溶蛋白膜的制备参考任聪等[15]研究方法。实验采用2%(单一干物质占乙醇溶液的比例，下同)的玉米醇溶蛋白，1%的甘油，0.25%的明胶，0.02%的纳他霉素，0.05%的乳酸链球菌素，分别与1%的卡拉胶、1%的琼脂及1%的琼脂/卡拉胶(1∶1)在80 ℃的水浴条件下，用200 mL体积分数为85%的乙醇溶液进行共混，待其充分溶解后流延于23×30 cm的玻璃板上，并于37 ℃的条件下干燥10 h，进而来制备玉米醇溶蛋白-卡拉胶复合抗菌膜(Ze-CA)，玉米醇溶蛋白-琼脂复合抗菌膜(Ze-AG)，玉米醇溶蛋白-卡拉胶/琼脂复合抗菌膜(Ze-CA/AG)，将制备好的复合抗菌膜于30%～50%的相对湿度条件储藏。

1.3.1 复合抗菌膜的性能表征1.3.1.1 厚度测试

1.3.1.2 水溶性测试

在60 ℃的条件下将复合抗菌膜裁剪成2 cm×2 cm大小的正方形干燥至恒质量M1，置于50 mL的蒸馏水中，浸泡15 h后取出，并于60 ℃的条件干燥至恒质量M2，根据式(1)得出复合膜的水溶性(W)[17]。

(1)

1.3.1.3 溶胀度测试

将复合抗菌膜裁剪成2 cm×2 cm大小的正方形，称质量m1，将其置于50 mL的蒸馏水中，静置5 h，取出复合膜用滤纸吸干表面的水分，称质量m2。根据式(2)进行计算溶胀度(S)[18]。

(2)

1.3.1.4 机械性能测试

实验采用ASTM D882-09的标准方法结合电子拉力机对复合膜的机械性能进行测定[19]，将膜制成2 mm×100 mm的样品，初始夹距为50 cm，上升速度为25 mm/min。

抗拉强度(TS)=

(3)

断裂伸长裂伸(EA)=

(4)

1.3.1.5 透氧性能测试

参考GB/T 1038—2000压差法对复合膜进行测试[20]。

1.3.1.6 透湿量的测试

将复合膜裁剪成直径为100 mm的圆形，参考GB/T 16928—1997[21]中的方法对膜的透湿量进行测定。

1.3.1.7 透光率及雾度测试

将复合膜裁剪成50 mm×50 mm的正方形，用夹具固定，根据GB/T 2410—2008[22]对其进行测试。

1.3.1.8 光泽度测试

选取入射角度为75°的光泽度测试仪，根据GB/T 8941—2007进行测试，标准板进行标定处理差值在1.2 Gs之内即可[23]。

1.3.1.9 色差测试[24]

利用色差仪对复合膜的颜色进行测定，L*为亮度，a*为发红度，b*为发黄度，ΔE为总色差，其中标准版中L*=94.30、a*=0.31、b*0.32。根据式(5)进行计算。

(5)

1.3.2 复合膜抑菌功能的研究1.3.2.1 抑制真菌实验

取保存好的黑曲霉菌种和根酶菌菌种，利用PDA固体培养基进行活化3代，用0.9%NaCl溶液将菌落浓度稀释至106cfu/g，并接种于PDA固体培养基上。将复合抗菌膜裁剪为6 mm的圆形，置于培养基中间，于28 ℃的条件下培养48 h，利用游标卡尺对抑菌圈直径进行测量。

1.3.2.2 抑制细菌实验

取保存好的金黄色葡萄球菌菌种和大肠杆菌菌种，利用LB肉汤培养基进行活化3代，同上将其稀释至106cfu/g，取1 mL菌液于100 mL肉汤培养基中。将复合抗菌膜裁剪为2 cm×2 cm的形状，浸没于培养基中，在37 ℃的条件下培养，分别在0、4、6、8、10、12、24 h时刻吸取培养液，在波长为600 nm对其吸光度值进行测定，通过吸光度的大小来表示细菌菌落数量，两者成正相关[25]。

1.4 复合膜的保鲜研究

分别将Ze-CA膜、Ze-AG膜、Ze-CA/AG膜制备成18 cm×25 cm的袋子，将100 g无籽葡萄装入其中，用双面胶进行封口处理，每粒葡萄保留根部，并设置空白组(CK)进对照，将葡萄置于20 ℃的条件下储藏，每隔1 d进行取样。

1.4.1 失重率的测定

失重率的测定采用式(6)进行计算[26]。

(6)

1.4.2 硬度的测定

利用 GY-4 型果实硬度计对果实的正反两面进行测定，取平均值[27]。

1.4.3 可溶性固形物含量的测定(SSC)的测定

将果实中部果肉榨汁过滤，将汁液置于阿贝折射仪上对SSC进行测定[28]。

1.4.4 可滴定酸含量的测定(TAC)

参照GB/T 12456—2008对水果的可滴定酸含量进行测定[29]。

1.5 数据处理

利用SPSS 20.0软件结合Duncan计算方法进行数据分析，P<0.05表示差异显著。所有指标均测量3次取平均值。

2 结果与分析

2.1 复合抗菌膜的性能表征分析

2.1.1 厚度分析

如图1所示，不同种复合抗菌膜的厚度值存在显著性差异(P<0.05)，可能是由于AG分子与Zein分子复合较好且CA分子与AG分子存在排斥现象，使其所有分子不能均匀分布在一个平面，进而导致Ze-CA/AG膜厚度最大，而Ze-AG膜厚度最小。

注：柱形图上的字母表示不同复合膜之间的差异性，字母相同表示差异不显著，字母不同表示差异显著，下同。图1 不同种复合抗菌膜的厚度

2.1.2 水溶性及溶胀度分析

水溶性和溶胀度是包装材料的重要性质，是反应包装材料遇到水分子后的表现制指标，水溶性可以用于衡量复合膜是否有利于降解，溶胀度可以体现对水分子的控制能力[30]。由图2可知，不同种复合抗菌膜的水溶性存在显著性差异(P<0.05)，Ze-AG的水溶性及溶胀度最低，说明该膜的内部分子结构紧密，分子间作用力强，水分子对其影响较小，相反水分子对Ze-CA膜的影响较大[31]。王键等[32]在水浴为80 ℃的条件下，利用80%乙醇对玉米醇溶蛋白、甘油、柠檬酸进行溶解得到的复合膜表面光滑、柔软，水溶性达到24.6%，实验制备的Ze-AG膜的水溶性与其接近。

图2 不同种复合抗菌膜的水溶性及溶胀度

2.1.3 机械性能分析

复合膜的机械性能对于其应用领域极为重要，抗拉强度和断裂伸长率在一定程度上呈反比关系，复合膜的厚度对于机械性能也有一定的影响，在一定的厚度范围内，厚度越大机械强度越大[33]。实验制备的Ze-AG膜与其他复合膜相比较具有较强的抗拉强度，其抗拉强度为(7.12±0.91)MPa，主要因为Ze-AG膜分子间氢键、离子键、二硫键的相互作用力大[11]。不同复合抗菌膜的抗拉强度和断裂伸长率均存在显著性差异(P<0.05)。刘校男等[34]利用料液比为1∶10的Zein和80%乙醇，甘油质量为Zein的20%制备的复合抗菌膜的拉伸强度为7.6 MPa，试验制备的Ze-AG抗拉强度与其较为一致。

图3 不同种复合抗菌膜的机械性能

2.1.4 透氧及透湿分析

透氧系数的大小与复合膜的透气性能成正比，透氧能力也是食品包装中最重要的参数之一，主要由于食品中存在的氧通常与氧化现象有关[35]。根据透氧系数可以设定被包装食品的周围气体环境，使其达到最适的气体浓度。由图4可知不同复合抗菌膜的透氧系数存在显著性差异(P<0.05)，Ze-CA膜的透氧系数最大，说明分子间的“孔隙”较大，而Ze-AG膜分子间的“孔隙”较小，进一步表明Ze-AG膜分子间的作用力大。对氧气的阻隔性较强。根据上述的溶胀度结果可知，复合膜具有较强的持水性能，因此采用减重法对复合膜的透湿量进行测定，大部分的水都被复合膜所吸收，只有极少数的水分透过复合膜，因此3种复合抗菌膜的透湿量不存在显著性差异(P>0.05)。

图4 不同种复合抗菌膜的透氧系数及透湿量

表1 不同复合膜的光学性能分析

2.1.5 光学性能分析

包装材料的颜色是食品包装中的关键参数，直接影响消费者对产品的接受程度。由表1可知，Ze-AG膜的亮度要明显优于其他2组，主要是由于Ze-AG膜的分子间各组分融合度较好，排列较为均匀、紧密，并且光泽度也高达(52.80±2.17)Gs，从而进一步证明了Ze-AG膜的机械性能高于其他组别的原因。因为Zein中含有一定的玉米黄素，导致主体颜色为黄色，并且在成膜基材中所占比较大，所以复合膜的总体颜色呈现出黄色。一般情况下，包装材料的透光率和雾度成反比关系，Ze-AG膜的透光率为(25.40±1.00)%，而马中苏等[36]制备的肉桂醛-浓缩乳清蛋白-壳聚糖复合抗菌膜的透光率为(57.66%±0.03)%，导致这一现象的原因是由于复合膜的整体颜色所引起的，因此在今后的研究中需要对复合膜进行脱色处理。

2.2 复合膜的抑菌性分析

食品的腐败变质主要是微生物导致的，因此在食品的流通过程中对微生物的控制极为重要。试验制备的复合抗菌膜能有效地抑制微生物的滋生，如图5～图7所示。Ze-CA/AG膜对真菌的抑制效果要明显优于其他处理组，主要由于Ze-CA/AG膜分子对于抗菌剂分子的作用力小，抗拉强度低，使其很容易被“释放”出来，进而实现对微生物的抑制，其中对黑曲霉和根霉的抑菌直径为(35.155±0.85)、(23.17±0.94)mm，同时Ze-CA/AG膜对细菌的抑制效果也较高。彭新玲[37]制备的负载纳他霉素的玉米醇溶蛋白/酪蛋白纳米复合膜能有效地抑制黑曲霉的滋生。孙海涛[38]制备的玉米磷酸酯淀粉/秸秆纳米纤维素/聚乙二醇膜/Nisin/ε-聚赖氨酸复合膜能有效地抑制大肠杆菌的滋生。这与本试验制备的复合抗菌膜的抑菌性一致。

图5 不同复合抗菌膜的抗真菌圈直径

图6 不同复合抗菌膜对大肠杆菌的抑制效果

图7 不同复合抗菌膜对金黄色葡萄球菌的抑制效果

2.3 复合抗菌膜的保鲜效果分析

2.3.1 不同复合抗菌膜对葡萄失重率的影响

葡萄失重率是衡量葡萄品质的重要指标，同时水分也是影响葡萄口感的重要因素。由图8可知，葡萄失重率随着储藏时间的延长逐渐增大，对于减缓葡萄失重率的增加复合膜组要明显优于空白组，并且在保鲜期内失水率Ze-CA/AG膜组

图8 不同复合抗菌膜对葡萄失重率的影响

2.3.2 不同复合抗菌膜对葡萄硬度的影响

葡萄果实的硬度可以直接影响到消费者的需求，同时也在其流通过程中，对其品质的评价提供了重要的参考依据。由图9可知，在储藏第6天时Ze-CA/AG膜组的果实硬度最大为(6.52±0.21)kg/cm2，而其他实验组在控制果实硬度下降也要好于空白组，硬度值的降低比例较小。原因可能是复合膜可以抑制葡萄的呼吸作用，减缓了葡萄果实中呼吸作用底物有机酸的消耗[40]。

图9 不同复合抗菌膜对葡萄硬度的影响

2.3.3 不同复合抗菌膜对葡萄可溶性固形物含量的影响

SSC是指溶容性糖类物质或其他可溶性物质，其含量的高低可以评价果实的品质。由图10可知，随着水分的流失及果实的进一步成熟，SSC含量会存在小幅度的上升而后开始下降。Ze-CA膜组SSC下降的比例最小为19.82%，Ze-CA/AG膜组次之为26.11%，Ze-AG膜组为29.47%，CK组最大为42.35%。复合膜能抑制葡萄果实进行无氧呼吸，减缓糖酵解途径的发生，使干物质消耗量减少[41]。

图10 不同复合抗菌膜对葡萄SSC的影响

2.3.4 不同复合抗菌膜对葡萄可滴定酸含量的影响

TAC是指葡萄中的游离态的酸，是葡萄品质的重要构成性状之一，是影响其果实风味及品质的重要因素[42]。由图11可知，相比较CK组，复合抗菌膜能有效地减缓葡萄中TAC的降低，复合膜中的抗菌剂可以有效抑制葡萄腐败菌的滋生，减缓组织氧化分解速度和可滴定酸的消耗。

图11 不同复合抗菌膜对葡萄TAC的影响

3 结论

Zein具有来源广泛、易于成膜等优良的理化性能，因此，研究采用2%的Zein，1%的甘油，0.25%的明胶，分别与1%的卡拉胶、1%的琼脂及1%的卡拉胶/琼脂进行共混制备复合膜，并且为了提升复合膜的保鲜效果，向成膜组分中加入了0.02%的Natamycin，0.05%的和Nisin，结果表明，实验制备的Ze-CA膜、Ze-CA/AG膜及Ze-AG膜具有较好的机械性能、阻隔性能和光学性能等理化指标，同时还能有效地抑制黑曲霉、根霉、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的滋生，Ze-CA/AG膜的抑菌效果要好于其他2组复合膜。试验将复合膜应用于葡萄的保鲜研究中发现，3种复合膜都能有效地减缓果实失重率的增加及硬度值、SSC、TAC的下降，有利于延长葡萄的货架期。接下来将对玉米醇溶蛋白/多糖/天然生物抗菌剂复合膜的微观结构及抗菌剂的迁移机制进行进一步研究。