茶皂素分离及脱皂茶粕生物发酵饲料的工艺条件优化

王丹媚， 张雅琦， 金 华， 盛可欣， 汪 妍， 黄瑞婷， 李春俣， 张晓菲， 饶米德， 刘 鹏

(浙江师范大学化学与生命科学学院, 金华 321004)

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)属于山茶科(Theaceae Mirb.)、山茶属(CamelliaL.)的常绿灌木植物[1]，其种子含油30%以上，不饱和脂肪酸质量分数高达90%，远远高于菜油、花生油和豆油，与橄榄油比维生素E含量高1倍，并含有山茶甙等特定生理活性物质，具有极高的营养价值[2,3]。油茶的根、茎、叶、种子均可入药，其药用功能主要为清热解毒、活血散瘀、止痛等[4]。此外，茶籽粕中含有茶皂素、茶籽多糖、茶籽蛋白等，它们都是化工、轻工、食品、饲料工业产品等的原料[5]。

目前，对油茶的利用仅停留在榨油及茶皂素的粗略提取上，而含有丰富纤维素和蛋白质的茶粕多作为燃料和清塘剂[6]，未能充分开发出有效价值，造成资源的严重浪费。现有的茶皂素提取方法如有机溶剂法、超声波辅助法、超临界法等[7]，大多存在提取率低、工艺复杂等问题，难以实现工业化生产。微波辅助法在乙醇/水溶液提取法的基础上增加了微波萃取这一环节，通过增大茶皂素的溶解度来提高提取率，可在一定程度上缓解上述问题[8]。

黑曲霉(Aspergillusnigerv.Tiegh)是一类环境友好型工业发酵菌种，可产生纤维素酶、果胶酶等多种酶[9]，有效降解茶皂素等生物质[10]，在饲料前期脱毒处理中具有重要意义。地衣芽孢杆菌作为一种土壤中常见的兼氧型革兰氏阳性菌[8]，对抗营养因子有拮抗作用[12]，可有效促进机体吸收营养物质，进而显著降低养殖的饲料系数，提高经济效应[13]。

目前，国内外对脱皂茶粕生物发酵饲料的应用探究较少，鲜见采取混菌二段式发酵的相关报道。将油茶籽粕提取茶皂素的同时加工残渣为饲料，不仅可有效减轻环境污染，也避免了资源浪费。因此，本研究以油茶粕为实验对象，采用微波辅助法提取茶皂素，利用黑曲霉进行脱毒前处理，并通过地衣芽孢杆菌发酵成优质饲料，探索其最佳工艺，为提高茶粕的利用价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

茶皂素标准品品(纯度：HPLC≥98%)，其他试剂均为分析纯，油茶籽粕，地衣芽孢杆菌种子液(23074，24236，24581)。

1.2 仪器与设备

SPARK 10M型酶标仪，G-16C型台式高速离心机，SB120DT型超声波清洗机，D-1型自动控制压力蒸汽灭菌锅。

1.3 实验设计

采用醇提法结合微波辅助提取供试油茶籽粕中的茶皂素，通过提取温度(40、50、60、70、80 ℃)、时间(30、60、90、120、150、180 min)、料液比(1∶6、1∶9、1∶12、1∶15、1∶18)、乙醇体积分数(40%、50%、60%、70%、80%)和微波功率(400、600、1 000 W)5个单因素结合响应面分析法，探究油茶籽粕中茶皂素的最佳提取工艺。

利用黑曲霉进行饲料脱毒前处理，根据定性分析结果筛选出降解茶皂素能力较强的黑曲霉，并对时间(4、6、8、10、12 d)、温度(25、30、35、40、45 ℃)、pH(3、4、5、6、7)和接种质量分数(3%、5%、8%、10%、15%)等因素进行优化；在地衣芽孢杆菌菌种配对的基础上，以产淀粉酶和蛋白酶能力为指标筛选出高产菌株，设置时间(12、24、36、48、60 h)、温度(35、40、45 ℃)、转速(120、150、180 r/min)为主要影响因素进行产酶条件优化。确定最佳时间(1、2、3、4、5 d)、pH(5、6、7、8、9)、温度(25、30、35、40、45 ℃)和接种质量分数(1%、2%、4%、6%、8%)等因素对脱皂茶粕发酵成饲料的影响。结合响应面优化模拟真实胃环境中饲料的消化情况，以糖和蛋白的消化率为指标确定最佳工艺条件。

1.4 实验方法

应用醇提法[14]和微波辅助乙醇法[15]提取茶籽饼粕中茶皂素；香草醛-浓硫酸显色法[16]测定茶皂素含量；紫环(Molish)反应[17]、发泡实验和溶血试验[18]测定发酵产物中残留茶皂素含量以筛选黑曲霉菌种；福林酚法(Lowry)[19]测定蛋白酶活性；Yoo改良法[20]测定α-淀粉酶酶活力；蒽酮比色定糖法[21]测定糖含量；考马斯亮蓝显色法[22]测定蛋白质含量。

1.5 数据处理

单因素实验数据使用Excel 2016，GraphPad Prism 6软件进行处理，数据表示为平均值±标准差(Standard Deviation，SD)差异显著性分析使用 SPSS 21.0 软件进行，不同字母表示显著差异(P<0.05)，响应面法实验数据使用Design Expert 8.0.6软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 茶皂素提取工艺优化

2.1.1 提取条件对茶皂素得率的影响

由图1可得，茶皂素的得率随温度的升高显著增大，在70 ℃时达到最佳，随后迅速下降。在浸提时间为30～150 min时，得率波动较小，在60 min时达最大。以料液比1∶12为界点，得率向两端逐渐降低。皂苷得率随着乙醇体积分数的增加显著提高，超过60%后趋于稳定，在70%达到最大。在微波功率400～1 000 W范围内，600 W时得率最大。综上，茶皂素提取最佳各单因素条件分别为温度70 ℃、时间60 min、料液比1∶12、乙醇体积分数70%和微波功率600 W。

图1 温度、时间、料液比、乙醇体积分数及微波功率对茶皂素得率的影响

2.1.2 茶皂素提取工艺响应面优化

结合单因素实验结果，利用响应面实验对各参数进行优化。温度、时间、料液比、乙醇体积分数4个因素中，乙醇体积分数和料液比的响应曲面较其余因素更为陡峭，说明两者对茶皂素得率影响更为显著。4种影响因素的优化值分别为温度71 ℃、时间66 min、料液比1∶12、乙醇体积分数70%，在此条件下以600 W微波辅助提取，茶皂素得率可达9.31%。

2.2 油茶籽粕脱毒

2.2.1 黑曲霉菌种筛选

相同条件下黑曲霉AU3与ZZ-5发酵产物所得气泡的绵密度和高度均存在较大差异，AU3的气泡绵密度更低且高度在5～10 d 下降56.58%，10～15 d下降39.39%，茶皂素含量在此发酵过程中经历了快速减少到缓慢减少的过程，不同于ZZ-5的气泡高度一直缓慢降低。Molish反应的紫环颜色是判断茶皂素含量的重要指标[23]，发酵后AU3所得紫色环颜色较同期ZZ-5更浅且更小。因此，黑曲霉AU3对茶皂素的降解效果优于菌种ZZ-5。

2.2.2 不同因素对茶皂素降解率的影响

选取黑曲霉AU3进行茶皂素降解单因素实验，结果如图2。黑曲霉可在10 d内有效降解茶籽饼粕中的茶皂素，发酵天数大于10 d时，黑曲霉降解率基本不变，因此最佳发酵时间为10 d。温度为35、40 ℃时茶皂素脱除率达最高，温度过高或过低时黑曲霉降解效果明显减弱，综合考虑最佳发酵温度为35 ℃。pH为 6时降解效果最好，过酸或过碱的环境均导致降解率下降，因此最佳发酵pH为6。随接种量的增加，茶皂素脱除率先上升后下降，在10%时达到最大，由此得出最佳黑曲霉接种质量分数为10%。

图2 不同因素下黑曲霉降解茶皂素的发泡情况

2.2.3 黑曲霉降解茶皂素响应面优化

经响应面优化，选择3种较优方案进行实验，分别为pH 6，接种质量分数10%，温度35 ℃，培养11 d；pH 6.5，接种质量分数12%，温度37.5 ℃，培养12 d；pH 6.5，接种质量分数10%，温度37.5 ℃，培养10 d。结果表明：发酵时间12 d、温度37.5 ℃、pH 6.5、接种质量分数12%的条件下，茶皂素含量可降解至0.188%，降解率达94.91%。

表1 不同方案下剩余茶皂素含量(平均值±标准误)

2.3 地衣芽孢杆菌发酵

2.3.1 地衣芽孢杆菌产酶菌种筛选

透明圈与菌落的平均直径比值(D/d)，在一定程度上反映了菌株产酶活力的大小[24]。通过测量不同培养基中透明圈及菌落直径得到D/d，地衣芽孢杆菌XJ423和B2在产淀粉酶、蛋白酶能力上分别具有较大优势。且两种菌在同一培养基上生长趋势相似，由此确定地衣芽孢杆菌XJ423和B2为后续脱皂茶粕的发酵菌种。

2.3.2 最适产酶条件确定

选取地衣芽孢杆菌XJ423和B2进行油茶籽粕发酵的单因素实验，以所得蛋白酶和淀粉酶活性之和作为衡量指标进行综合比较，结果如表2所示，在产酶时间为36 h、温度为40 ℃、转速为150 r/min时两值之和最大，说明该条件下菌综合产酶能力最强。

表2 不同时间、温度、转速下蛋白酶和淀粉酶的活力(平均值±标准误)

2.3.3 各因素对发酵茶粕糖、蛋白含量的影响

蛋白含量和糖含量是衡量高品质饲料的重要营养参数[25]，将菌种接种到油茶籽粕培养基中进行发酵条件的单因素实验，对反应所得产物中的蛋白含量、糖含量进行测定，结果如图3。各组蛋白及糖含量均呈先上升后下降的趋势，可得最佳发酵时间为4 d、pH为7、接种质量分数为2%、温度为35 ℃。

图3 发酵温度、时间、pH、接种量对发酵茶粕糖含量和蛋白含量的影响

2.3.4 发酵条件响应面优化

时间、pH、接种量、温度4因素中，温度和pH的响应面图弧度较大，表明二者对茶粕发酵后蛋白质含量影响较大，接种比的响应面最为平坦，说明其对发酵茶粕蛋白质含量影响最小。由响应面优化法预测发酵条件为时间3.6 d、pH 7.1、接种质量分数5%、温度34 ℃时，发酵茶粕中糖含量最高；发酵条件为时间3.4 d、pH 6.6、接种质量分数6%、温度32 ℃时，蛋白质含量最高。对两方案进行实验，结果表明：发酵时间为3.6 d、pH 7.1、接种质量分数5%、温度34 ℃时，地芽孢杆菌发酵茶粕的效果最优，通过模拟胃消化过程，测得消化率为21.62%。

3 结论

本研究采用微波辅助提取法，通过单因素实验及响应面优化，确定茶皂素提取最佳工艺参数为时间62 min、温度71 ℃、料液比1∶12、乙醇体积分数72%、微波功率600 W，此条件下茶皂素得率可达9.31%，此法可有效缩短萃取时间、提高得率，为茶皂素的高效提取提供了可行方法。

采取发泡和Molish实验定性比较茶皂素含量，黑曲霉AU3和ZZ-5对茶皂素均有一定降解效果，其中AU3能在短时间内降解大量茶皂苷，效果明显优于ZZ-5，因此选用AU3参与后续实验。通过单因素实验及响应面优化，确定皂苷降解最佳工艺参数为时间12 d、温度37.5 ℃、pH 6.5、接种质量分数12%，此条件下降解率可达94.91%。

选取地衣芽孢杆菌用于脱皂茶粕发酵成饲料，根据单因素实验和响应面优化，得到最佳发酵条件为时间3.6 d、温度34 ℃、pH 7.1、接种质量分数5%，此条件下所得饲料中糖和蛋白质含量最高。在模拟胃消化过程中，饲料中糖及蛋白消化率达21.62%。

本实验研究了黑曲霉及2种地衣芽孢杆菌在发酵中的最佳接种比，寻找菌的最适接入时间差，采取活体饲养，明确发酵效果，有利于皂素工业化生产和优良蛋白饲料资源的规模化开发。