高效液相色谱法测定果皮丹中苯甲酸和山梨酸的不确定度评估
2022-11-24梁洁怡张志舟梁柳泳舒永红
梁洁怡，张志舟，梁柳泳，张 飞，舒永红
(广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心)，广东省化学测量与应急检测技术重点实验室，广东 广州 510070)
果皮丹是以各种残次水果(苹果、香蕉、草莓、香梨、甜橙、柑橘、山楂、菠萝、芒果、荔枝、猕猴桃等)为原料，通过现代工艺，加工成携带方便、开袋即食的小包装产品。产品营养丰富，富含维生素、矿物质，是聚会、休闲、旅游的佳品，深受广大群众喜爱。苯甲酸、山梨酸是食品中常用的防腐剂，具有抗微生物活性效果明显、价格便宜等优点，因此被广泛添加于各种果脯、蜜饯、调味料、腌制蔬菜、果汁饮料、果酒等食品中[1]。由于它们被人体摄入过量会造成一定伤害[2]，国家食品卫生标准GB 2760-2014对其使用有明确的限量规定，果皮丹属于蜜饯凉果类，其中苯甲酸、山梨酸最大添加量为 0.5 g/kg[3]。因此如何客观准确地测量其含量对企业防腐剂的添加具有指导作用。
测量不确定度是对测量结果质量的定量评估[4]，不确定度值愈小，表示结果与被测量的真值愈接近，质量越高[5-6]。高效液相色谱法(HPLC)测定苯甲酸、山梨酸的不确定度评定已有许多报道[7-11]，但在给出不确定度报告时，存在或这或那的问题：测量结果未修约到其末位与不确定度的末位一致、最终报告的扩展不确定度多于两位有效数字和不确定度数字修约不规范等。本研究根据食品安全国家标准GB 5009.28-2016第一法，采用液相色谱法对食品果皮丹中苯甲酸和山梨酸进行测定[12]，结合JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[13]和CNAS-GL006: 2019《化学分析中不确定度的评估指南》[14]对苯甲酸和山梨酸的测量不确定度进行评定，找出影响不确定度的主要因素，合理、规范地给出扩展不确定度表示方式，为实验室质量控制提供科学、准确、可靠的依据，保证检测结果的质量。
1 实验部分
1.1 材料
果皮丹购自广州市某超市，取一定量捣碎，混匀，装入密闭塑料容器中，备用。
1.2 试剂
苯甲酸对照品(99.96%±0.30%)、山梨酸对照品(99.18%±0.50%)，DR公司;亚铁氰化钾、乙酸锌(分析纯)，乙酸铵、甲酸、甲醇(色谱纯)，广州化学试剂厂;实验室用水(一级水)。
1.3 仪器
LC-20AD型高效液相色谱仪，SHIMADZU公司;涡旋振荡器，IKA®MS 3 basis;KQ2200B超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);离心机，cense®湘仪TDZS-WS;BSA224S(d=0.1 mg)、BT125D(d=0.01 mg)电子天平，德国赛多利斯公司。
1.4 实验方法
1.4.1 标准储备溶液
分别准确称取苯甲酸和山梨酸标准品0.05002和 0.05042 g(精确至 0.00001 g)，置于 50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，此为 1000 mg/L 苯甲酸和山梨酸标准储备溶液;混合标准系列工作溶液由此储备液稀释而成。
1.4.2 样品测定
称取 2 g(精确至 0.001 g)试样，置 50 mL 离心管中，加入水约 25 mL，涡旋混匀，于 50 ℃ 水浴超声 20 min，冷却至室温后加亚铁氰化钾溶液 2 mL和乙酸锌溶液 2 mL，混匀，于 8000 r/min 离心 5 min，将水相转移至 50 mL 容量瓶中，于残渣中加水 20 mL，涡旋混匀后超声 5 min，于 8000 r/min 离心 5 min，将水相转移至同一 50 mL 容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀，取适量上清液过 0.22 μm 滤膜，待液相色谱测定。
2 结果与讨论
2.1 数学模型
根据测试方法和实验原理，试样中苯甲酸和山梨酸的质量分数按式(1)计算：
(1)
式中：X——试样中待测组分质量分数，g/kg;ρ——试液中待测组分质量浓度，mg/L;V——试液定容体积，mL;m——试样质量，g;1000——由mg/kg转换为g/kg的换算因子。
2.2 不确定度来源分析
根据试验方法和数学模型式(1)可知，果皮丹中苯甲酸和山梨酸含量测定的不确定度主要来源有：① 试液中苯甲酸和山梨酸的测定浓度;② 试样定容体积;③ 试样质量;④重复性;⑤ 提取过程对样品回收率影响。
不确定度来源如图1所示。
图1 不确定度来源
2.3 不确定度分量及计算
2.3.1 样品称量m带来的不确定度u(m)
称取果皮丹样品 2 g，考虑到称量分两次进行，则称量带来的不确定度如下。
2.3.1.1 示值误差
BSA224S电子天平校准证书显示示值误差的测量扩展不确定度：U=0.0003 g，k=2;则标准不确定度为：
2.3.1.2 重复性
校准证书显示重复性偏差为 0.0001 g，此结果为极差值，根据JJG 1036-2008《电子天平》重复性测试至少6次，按6次计，根据JJF 1059-1999《测量不确定度评定与表示》查得系数C2为2.53，则由天平重复性带来的不确定度为：
2.3.1.3 偏载误差
校准证书显示偏载误差最大值为+0.0001 g，最小值为 0.0000 g，测试位置为5点，查得系数C3为2.33，则由天平偏载误差带来的不确定度为：
由于称量时需操作两次，一次为清零，另一次为读数，所以应记两次不确定度，所以由天平称量带来的标准不确定度为：
u(m)=
相对标准不确定度为：
2.3.2 使用 50 mL 容量瓶定容样品溶液产生的不确定度u(V)
1)容量瓶的最大允许误差
50 mL 容量瓶最大允许误差为±0.065 mL，按三角分布换算成标准偏差为
2)重复充满液体至容量瓶刻度的变动性
重复充满液体至容量瓶刻度的变动性通过10次重复测量，其变动性标准偏差为
SD50 mL=0.0098 mL。
3)温度变化带来的不确定度
容量瓶和溶液温度与校正时温度不同引起的体积不确定度为50×2.1×10-4×5=0.053 mL(水体积膨胀系数为2.1×10-4/℃，假定实验室温度为25℃)，在95%置信概率下，换算成标准不确定度为
u2=0.053/1.96=0.027 mL
由以上三项合成得出
则样品定容体积的相对标准不确定度为
2.3.3 试液中苯甲酸和山梨酸质量浓度ρ引入的不确定度u(ρ)
试液中苯甲酸和山梨酸质量浓度ρ的不确定度主要主要有3个来源，一是标准储备溶液的配制，二是由标准储备溶液稀释成系列工作溶液产生的不确定度，三是标准曲线拟合带来的不确定度。
2.3.3.1 标准储备溶液配制产生的不确定度
用BT125D电子天平(d=0.01 mg)分别准确称取苯甲酸和山梨酸标准品 0.05002 g 和 0.05042 g(精确至 0.000 01 g)，置于 50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，此为 1000 mg/L 苯甲酸和山梨酸标准储备溶液，计算公式为：
式中：ρs——苯甲酸和山梨酸标准储备溶液，mg/L;w——苯甲酸和山梨酸标准品纯度，%;mst——苯甲酸和山梨酸标准品质量，g;Vst——苯甲酸和山梨酸标准品定容体积，mL。
1)苯甲酸和山梨酸标准品纯度w带来的不确定度
苯甲酸标准品纯度w苯为99.96%±0.30%，扩展不确定度为0.30%(k=2);山梨酸标准品纯度w山为99.18%±0.50%，扩展不确定度为0.50%(k=2)。则w苯和w山引入的相对标准不确定度为：
2)苯甲酸和山梨酸标准品称样量带来的不确定度
(a)BT125D电子天平(d=0.01 mg)的示值误差：校准证书显示示值误差的测量扩展不确定度：U=0.00003 g，k=2;则标准不确定度为：
(b)重复性：校准证书显示重复性偏差为 0.00002 g，此结果为极差值，根据JJG 1036-2008《电子天平》重复性测试至少6次，按6次计，根据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》查得系数C2为2.57，则由天平重复性带来的不确定度为：
(c)偏载误差：校准证书显示偏载误差最大值为+0.00004 g，最小值为+0.00002 g，测试位置为5点，查得系数C3为2.33，则由天平偏载误差带来的不确定度为：
由于称量时需操作两次，一次为清零，另一次为读数，所以应记两次不确定度，所以由天平称量带来的标准不确定度为：
u(mst)=
=0.000027 g，
则苯甲酸和山梨酸标准品称样量带来的相对标准不确定度为：
3)苯甲酸和山梨酸标准品定容体积 50 mL 容量瓶带来的不确定度
根据2.3.2，苯甲酸和山梨酸标准品定容体积 50 mL 容量瓶带来的相对标准不确定度为：
urel(Vst)=0.00079。
则配制苯甲酸和山梨酸标准储备液引入的相对标准不确定度为：
2.3.3.2 由标准储备溶液稀释成系列工作溶液产生的不确定度
以 20 mg/L 苯甲酸和山梨酸标准溶液为例，用 1 mL 移液管移取 1 mL 标准储备液到 50 mL 容量瓶，稀释到刻度。
1 mL 移液管的标准不确定度由校准获得为 0.0018 mL，则相对标准不确定度为0.0018，50 mL 容量瓶的相对标准不确定度由2.3.2求得为0.00079，故
u(ρ01苯)=0.0027×20=0.054 mg/L，
u(ρ01山)=0.0033×20=0.066 mg/L。
2.3.3.3 标准系列线性拟合带来的不确定度
分别取苯甲酸和山梨酸标准系列溶液依次注入高效液相色谱仪进行分析，测定各组色谱峰面积，结果见表1。
表1 苯甲酸和山梨酸标准溶液系列质量浓度的峰面积
将表1中数据进行线性拟合得如下直线方程：
S苯=a苯×ρ苯+b苯=34754.4ρ苯-684.53;S山=a山×ρ山+b山=65171.1ρ山-2513.72。
以苯甲酸为例，其中a苯=34754.4，b苯=-684.53;S为色谱峰面积;ρ苯为苯甲酸浓度。对各平行样品中的苯甲酸含量进1次测定，由色谱峰面积通过直线方程求得ρ0苯=24.5 mg/L，则ρ0苯的标准不确定度为：
式中：
a=34754.4，
P=1(对ρ进行1次测量)，
n=7(每个质量浓度进行1次测量，共1×7=7次)，
=0.41 mg/L。
同样可以求得山梨酸测试浓度(ρ0山=7.12 mg/L)的标准不确定度为：u(ρ0山)=0.21 mg/L，
则测定试液中苯甲酸和山梨酸质量浓度引入的标准不确定分别为：
换算成相对标准不确定度为：
2.3.4 样品重复性试验带来的不确定度u(Frep)
在重复性条件下，对该样品进行了6次独立测量，苯甲酸的质量分数分别为0.582、0.570、0.566、0.577、0.571 g/kg 和 0.589 g/kg，其算术平均值为 0.576 g/kg;山梨酸的质量分数分别为0.165、0.163、0.171、0.158、0.166 g/kg 和 0.161 g/kg，其算术平均值为 0.164 g/kg。
单次测量的标准不确定度为：
u(w苯i)=s(w苯i)
u(w山i)=s(w山i)
实际样品检测时通常做平行双样，则算术平均值的标准不确定度为(n=2)：
因此重复测定带来的相对不确定度为：
2.3.5 回收率R带来的不确定度u(R)
由于样品提取不完全或提取过程导致待测组分的损失或污染等，将使样品中苯甲酸和山梨酸不能100%进入到测定液中，本实验室在测定果皮丹中苯甲酸和山梨酸含量时，进行了6次加标回收试验，测得苯甲酸的回收率为88.0%、88.4%、87.0%、88.6%、90.0%和87.4%，平均值为88.2%;山梨酸的回收率为89.8%、90.2%、91.5%、88.5%、90.4%和89.8%，平均值为90.0%。则回收率的标准不确定度u(R)为：
u(R苯)=s(R苯)
u(R山)=s(R山)
换算成相对标准不确定度为：
2.4 各不确定度分量的合成
将各相对标准不确定度分量进行汇总，如表2所示。图2和图3分别为苯甲酸和山梨酸各相对标准不确定度分量柱状图。
表2 苯甲酸和山梨酸的相对标准不确定度
图2 苯甲酸各不确定度分量图 图3 山梨酸各不确定度分量图
由表2和图2、图3可以看出，测试液中苯甲酸和山梨酸质量浓度的测定过程引入的不确定度最大，是影响测量结果不确定度的主要因素;其次是回收率和重复测定引入的不确定度;样品称量和定容体积带来的不确定度很小，可以忽略不计。
合成各不确定度分量值，得：
则：
u(w苯)=0.024×0.576=0.014 g/kg，
u(w山)=0.038×0.164=0.0062 g/kg。
2.5 扩展不确定度及结果表示
根据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[13]，在95% 置信水平下，取包含因子k=2，果皮丹样品中苯甲酸和山梨酸的扩展不确定度分别为：U苯=2×0.014=0.028 g/kg，U山=2×0.0062=0.0124≈0.013 g/kg。
则果皮丹样品中苯甲酸和山梨酸质量分数结果表示为：
w苯=(0.576±0.028)g/kg，k=2;
w山=(0.164±0.013)g/kg，k=2。
3 结论
本研究对样品称量、玻璃器皿、标准溶液的配制、样品重复性测定、加标回收、标准曲线拟合等因素进行综合考察，在各不确定度分量评定过程中，发现标准曲线拟合产生的不确定度对合成标准不确定度贡献最大，是实际工作中应加以控制的关键点;其次是回收率和重复性测定引入的不确定度。因此，在标准曲线配制过程中，尽量使用纯度高的标准品，使用计量检定合格的容量瓶和移液管，准确配制和移取标准溶液，设计工作曲线时应使样品溶液浓度位于工作曲线的中间，适当增加标准系列质量浓度点和测定次数，使标准曲线相关系数尽量达到0.999以上，都可以减小由标准曲线线性拟合所产生的不确定度。同时，在样品提取过程中，严格控制好条件，防止待测组分提取不完全或污染，降低样品预处理过程带来的不确定度。
