纳米金粒子表面等离子共振吸收检测食品中莱克多巴胺

胡娅琪， 张 博， 姚 琳， 秦 蓓*

(西安医学院药学院，药物研究所，陕西西安 710021)

莱克多巴胺(Ractopamine,Rac)作为一种β-受体激动剂常被用于添加到动物饲料中以降低脂肪水平和促进肌肉组织生长[1,2]。但由于Rac稳定性较高，容易在体内积聚而引起一系列严重的健康问题[3]，许多国家禁止使用Rac[4,5]，因此从食品安全角度开发一种简单、灵敏可用于食品中Rac检测的方法具有重要意义。目前，Rac的测定技术包括高效液相色谱法[6]，色谱-质谱联用技术[7]，表面增强拉曼光谱法[8]和免疫色谱法[9]。虽然这些方法具有较高的选择性和灵敏度，但复杂的样品处理过程和昂贵的仪器设备无法满足实时和现场测定。因此，开发简单、便捷的Rac检测方法尤为迫切。例如电化学传感器[10]和荧光传感器[11]用于复杂样品中Rac的测定，以单克隆抗体为探针开发了特异性识别Rac的免疫分析方法[12]。这些方法在检测技术和样品处理方面有了很大的改进。然而，要实现简单、快速、直观地用于食品中Rac的检测仍然是一个挑战。在众多传感器的设计中基于Au NPs表面等离子共振吸收发展起来的可视化分析技术被广泛地用于金属离子[13]，生物活性分子[14]，霉菌毒素[15]，药物[16]和污染物[17]的检测。其中应用可视化方法检测Rac研究也有报道。例如，Hu等[18]开发了一种基于对氨基苯磺酸修饰的Au-Ag合金纳米粒子的可视化传感器用于Rac检测。Zhou等[19]将三聚氰胺修饰在Au NPs表面利用三聚氰胺和Rac之间的氢键作用构建了一种Rac可视化传感器。基于Au NPs等离子共振吸收对Rac的分析检测主要是以未修饰的柠檬酸盐稳定Au NPs[20]，以及功能单分子修饰为主[18,19]。

目前，双分子功能化Au NPs用于肉类和乳类食品中Rac可视化检测的研究鲜有报道。本文以L-半胱氨酸(L-Cys)和对巯基苯硼酸(MBA)作为修饰剂合成双分子功能化Au NPs(L-Cys/MBA-Au NPs)，利用L-Cys和MBA分子上的丰富的氨基、羧基和羟基基团增加了与Rac之间氢键作用的识别位点，以及MBA影响了L-Cys/MBA-Au NPs微环境，使得粒子发生聚集，紫外光谱和颜色发生变化。基于此原理，构建了一种灵敏、选择性检测Rac的可视化传感器，并成功地应用于牛奶和猪肉样品中Rac的检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Cary60紫外-可见分光光度计(美国安捷伦科技有限公司)，JEM-2100高分辨透射电子显微镜(TEM，日立高新技术有限公司)。

HAuCl4·3H2O、抗坏血酸(AA)、果糖(Fru)、乳糖(Lac)、赖氨酸(Lys)、尿素(Urea)、柠檬酸钠、对巯基苯硼酸(MBA)和L-半胱氨酸(L-Cys)均购自于阿拉丁试剂有限公司(上海)，莱克多巴胺(Rac)标准溶液(3 mmol/L，甲醇溶解)购自源叶试剂有限公司(上海)。所用试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 Au NPs的制备

所有的玻璃仪器均依次用实验室配制的王水溶液、去离子水彻底清洗后，烘干备用。Au NPs根据文献报道方法制备[21]：将5 mL 38.8 mmol/L的柠檬酸三钠在剧烈搅拌条件下快速加入到沸腾的100 mL 0.4 mmol/L HAuCl4溶液中，持续沸腾30 min直至得到红色的Au NPs溶液，溶液冷却至室温，用0.22 μm滤膜过滤除去残渣，滤液存至4 ℃冰箱中备用。根据TEM表征，制备的Au NPs粒径大约为11 nm。根据其紫外-可见吸收光谱和平均粒径，计算得到其浓度约为10 nmol/L，估算摩尔吸光系数为ε450=8.27×107L/(mol·cm)[22]。

1.3 功能化Au NPs(L-Cys/MBA-Au NPs)的制备

Au NPs的功能化通过配体交换方法制备得到：将5 μL 1 mmol/L L-Cys和35 μL 1 mmol/L MBA溶液加入到10 mL上述制备得到的10 nmol/L Au NPs中，将混合溶液在搅拌条件下反应30 min，最终得到L-Cys/MBA-Au NPs溶液，4 ℃下保存备用。

1.4 Rac的可视化分析

将不同体积0.3 mmol/L Rac溶液加入到1 mL 4.5 nmol/L L-Cys/MBA-Au NPs溶液中得到0.2、0.5、1.0、1.6、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10、15 μmol/L Rac溶液，混匀后室温反应15 min，溶液颜色改变通过华为手机拍摄，光谱通过紫外-可见分光光度计测定。以L-Cys/MBA-Au NPs在670 nm和518 nm处的吸光度比值(A670/A518)作为分析信号。

1.5 样品分析

牛奶样品依据文献处理[23]：首先将1 mL牛奶用1 mol/L HCl调节至pH为4.6，搅拌2 min，12 000 r/min离心10 min；取上清液1 mL,加入400 μL甲醇后，12 000 r/min离心10 min，得上清液作为空白样品溶液。猪肉样品依据文献处理[24]：称取5 g碎猪肉,加入10 mL无水乙醇浸泡20 min,超声30 min,真空泵抽滤，将初滤液12 000 r/min离心10 min除去部分滤渣，得到最终滤液为空白样品溶液。向上述得到的牛奶和猪肉样品空白溶液中加入Rac母液可得加标样品溶液。分别取0.7 μL、6.9 μL、34.5 μL 0.3 mmol/L Rac加标样品溶液加入到1 mL L-Cys/PBA-Au NPs中，可得浓度分别为0.2 μmol/L、2.0 μmol/L和10 μmol/L的Rac实际样品测定溶液,反应15 min后进行紫外可见光谱扫描。

2 结果与讨论

2.1 实验原理

图1为L-Cys/MBA-Au NPs的制备及对Rac的可视化分析原理示意图。L-Cys和MBA的巯基可以通过形成较强Au-S键修饰在Au NPs表面，L-Cys/MBA-Au NPs外表面的氨/羟基/羧基和Rac中的羟基和氨基具有较强的氢键[25,26]，此外，MBA可以改善L-Cys/MBA-Au NPs表面的微环境[27]，使L-Cys/MBA-Au NPs发生聚集。加入20 μmol/L Rac后，A670/A518比值明显高于单独以L-Cys或MBA修饰的Au NPs，因此L-Cys/MBA-Au NPs可作为探针用于Rac的测定。

图1 L-Cys/MBA-Au NPs对Rac的可视化检测原理示意图Fig.1 Scheme of possible mechanism for the determination of Rac using L-Cys/MBA-Au NPs

2.2 L-Cys/MBA-Au NPs的表征

柠檬酸钠还原方法制得的Au NPs呈球形，粒径约为11 nm(图2A)，Au NPs在518 nm处有其典型的特征吸收峰且溶液呈红色(图2D，曲线1，插图1)，归因于Au NPs 的表面等离子共振吸收[28]。当MBA和L-Cys修饰到Au NPs表面后，Au NPs的分散程度(图2B)和吸收峰位置没有发生明显的改变(图2D，曲线2)。当20 μmol/L Rac加入到L-Cys/MBA-Au NPs溶液中，L-Cys/MBA-Au NPs发生了明显的聚集(图2C)，在670 nm处出现新的吸收峰，同时颜色由红色变为紫色(图2D，曲线3，插图3)。说明L-Cys/MBA-Au NPs可以作为探针用于Rac的可视化检测。

图2 (A) Au NPs,(B) L-Cys/MBA-Au NPs,(C) L-Cys/MBA-Au NPs溶液加入20 μmol/L Rac的透射电镜。(D) 紫外-可见吸收光谱(1) Au NPs;(2) L-Cys/MBA-Au NPs;(3) L-Cys/MBA-Au NPs溶液加入20 μmol/L Rac，插图为对应溶液的照片Fig.2 TEM images of (A) Au NPs,(B) L-Cys/MBA-Au NPs and(C) L-Cys/MBA-Au NPs with the addition of 20 μmol/L Rac,(D) UV-Vis absorption spectra of (1) Au NPs,(2) L-Cys/MBA-Au NPs and (3) L-Cys/MBA-Au NPs with the addition of 20 μmol/L Rac.Inset:Photographs of corresponding solutions

2.3 实验条件优化

2.3.1 L-Cys和MBA浓度比的选择如图3A所示，当L-Cys和MBA的摩尔比(cL-Cys/cMBA)从5∶1降至1∶7，670 nm处的吸光度增大，518 nm处的吸光度降低，A670/A518比值持续增大(图3B)，当浓度比从1∶7降至1∶9时A670/A518几乎不变，因此选择1∶7为修饰分子L-Cys和MBA的最佳浓度比。

图3 L-Cys与MBA不同比值时L-Cys/MBA-Au NPs溶液加入20 μmol/L Rac的紫外-可见吸收光谱(A) 与对应A670/A518的关系(B)Fig.3 (A) UV-Vis absorption spectra and (B) the absorbance ratios of A670/A518 of Au NPs functionalized by different concentration ratios of L-Cys and MBA with the addition of 20 μmol/L Raca-m：The molar ratio of L-Cys and MBA(cL-Cys/cMBA) was 5,4,3,2,1,1∶2,1∶3,1∶4,1∶5,1∶6,1∶7,1∶8 and 1∶9.

2.3.2 L-Cys/MBA-AuNPs浓度的优化随着L-Cys/MBA-Au NPs浓度的增大(2 nmol/L～9.5 nmol/L)，加入20 μmol/L Rac后L-Cys/MBA-Au NPs在518 nm和670 nm处的吸光度持续增大(图4A)，在2～3 nmol/L范围内A670/A518逐渐增大然后逐渐减小(图4B)。为了保证最佳的响应信号以及可视化效果，4.5 nmol/L为L-Cys/MBA-Au NPs的最佳浓度。

图4 (A)不同浓度L-Cys/MBA-Au NPs溶液加入20 μmol/L Rac的紫外-可见吸收光谱，(B) A670/A518值与L-Cys/MBA-Au NPs浓度的关系Fig.4 (A) UV-Vis absorption spectra of different concentrations of L-Cys/MBA-Au NPs with the addition of 20 μmol/L Rac.(B) The dependence of the absorbance ratio of A670/A518 on the concentrations of L-Cys/MBA-Au NPsThe concentration of L-Cys/MBA-AuNPs(a - p):2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0 and 9.5 nmol/L.

2.3.3 反应时间的选择实验考察了反应时间对可视化响应信号的影响(图5)，当反应时间为15 min时，A670/A518基本达到最大稳定值，表明15 min足以达到反应平衡。因此L-Cys/MBA-Au NPs测定Rac的最佳反应时间为15 min。

图5 A670/A518与反应时间的关系Fig.5 The influence of incubation time on the absorbance ratio of A670/A518 for 4.5 nmol/L L-Cys/MBA-Au NPs with the addition of 20 μmol/L Rac

2.4 Rac的可视化检测

在最优条件下，以A670/A518作为响应信号进行Rac定量分析。如图6所示，当Rac浓度从200 nmol/L逐渐增加到100 μmol/L时，518 nm处的吸收峰逐渐减小，在670 nm处出现一个新的吸收峰并且吸光度逐渐增大。可以清楚地看到颜色从红色变成紫色，最后变成紫蓝色(图6中插图)。在200 nmol/L～15 μmol/L范围内，A670/A518值与Rac浓度呈良好的线性关系，线性方程为y=0.0875x+0.1038(R2=0.9942)，检测限(S/N=3)为95.38 nmol/L。

图6 L-Cys/MBA-Au NPs溶液加入不同浓度Rac的紫外-可见吸收光谱Fig.6 (A) UV-Vis absorption spectra of L-Cys/MBA-Au NPs with different concentrations of RaccRac(a - o):0.20,0.50,1.0,1.6,2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,10,15 μmol/L.

2.5 选择性

为了评价该可视化方法的选择性，对实际样品中可能存在的AA、Fru、Lac、Lys、Urea、KCl、NaCl、CaCl2、和FeCl3等常见干扰物进行了研究，以评价所建立的Rac检测方法的特异性和选择性。如图7所示，将20 μmol/L Rac加入L-Cys/MBA-Au NPs，引起A670/A518值急剧增加，对应溶液颜色由红色变为紫蓝色。在相同的实验条件下，将200 μmol/L干扰物加入到L-Cys/MBA-Au NPs中，A670/A518变化不大，对应溶液颜色基本无变化，说明可视化传感器对Rac有较好的选择性。

图7 可视化传感器的选择性实验Fig.7 Selectivity of the colorimetric sensor

2.6 实际样品检测

为了考察该方法的实际应用，在牛奶和猪肉样品中进行了加标回收实验，每个样品平行测定5次，牛奶和猪肉中均未检出Rac。如表1所示，牛奶样品中Rac的平均回收率分别为99.5%～126.9%，猪肉样品平均回收率为92.5%～103.8%，RSD均小于5%，说明该方法准确、可靠，能够实现检测实际样品Rac的检测。

表1 样品中Rac的测定结果及其回收率Table 1 Recovery results of Rac in real samples

3 结论

本文以L-Cys/MBA-Au NPs为探针，建立了一种简单、便捷检测Rac的可视化传感器。该传感器的构建基于Rac中的羟基和氨基与L-Cys/MBA-Au NPs的羟基/羧基/氨基具有强烈的氢键作用使得L-Cys/MBA-Au NPs由红色变为紫色，同时吸收光谱发生改变。该传感器具有良好的灵敏度、选择性，可用于实际样品中Rac的检测。