注射泵辅助微固相萃取-气相色谱-串联质谱法检测大米中有机磷类农药残留

张隽娴， 郑 程， 郑 丹， 刘 丽， 彭西甜

(湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农产品营养品质与安全湖北省重点实验室/农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(武汉)，湖北武汉 430064)

农药在农业生产中的应用非常广泛，其大大提高了农产品的产量，另一方面，农药残留造成的食品安全问题也引起了政府和社会越来越多的关注[1,2]。有机磷农药是目前生产中常用的一类杀虫剂，其主要作用机理是可以和昆虫体内的乙酰胆碱酶结合，从而抑制昆虫体内乙酰胆碱酶的活性，使害虫死亡[3,4]。然而，大部分有机磷农药属于高毒性农药，可引发急性毒性，损害肌体，引起机体痉挛、瘫痪等一系列神经中毒症状、甚至死亡[5]。因此，建立食品和农产品中有机磷类农药残留的快速、灵敏和高效的分析方法具有重要的意义。

在农药残留分析中，样品制备很关键。当前，样品制备技术越来越向微型化和绿色化的方向发展，即要求能够提供快速、高效萃取的同时减少有机溶剂消耗[6]。微固相萃取(Micro-Solid Phase Extraction，μ-SPE)很好地满足了这一要求[7]。金属有机骨架材料(Metal-Organic Frameworks，MOFs)是由有机配位体和金属离子或团簇通过配位键自组装形成的具有高发达分子内孔隙的有机-无机杂化材料，近年来在气体储存、二氧化碳的捕获、催化、吸附、生物成像、药物分离等领域呈现出重要的价值[8 - 10]。MOFs具有孔隙率高、比表面积大和吸附位点多的特点，非常适合作为μ-SPE的吸附剂[7,9,11]。

目前，气相色谱-质谱法(GC-MS)[12 - 14]、气相色谱-火焰光度检测器(GC-FPD)[15,16]、液相色谱-质谱法(LC-MS)[17,18]等已经被用于各种样品中有机磷类农药的检测。其中质谱检测器具有更好的选择性和灵敏度，在食品安全分析中应用越来越广泛。在本文中，我们采用水热法一步合成了一种氨基官能化的MOF材料MIL-101-NH2(Cr)，将其作为注射泵辅助的μ-SPE吸附剂，首次用于稻米样品中有机磷类农药残留的快速萃取。吸附剂首先负载在有机滤头上，样品溶液在注射泵的推动下经过有机滤膜上的吸附剂完成萃取，萃取结束后直接解吸进样，避免了传统分散μ-SPE过程中的离心步骤，大大提高了样品分析的通量。结合GC-MS的分离检测，建立了一种稻米中6种有机磷类农药的快速、高效分析方法。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

GCMS-TQ8030型气相色谱-三重四极杆串联质谱仪(日本Shimadzu公司)；AOC-20S/20i自动进样器(日本Shimadzu公司)；LSP04-1A恒流泵(保定兰格恒流泵有限公司)；METTLER TOLEDO电子天平(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司)；IKA MS 3 basic型涡旋仪(德国IKA公司)；N-EVAP111氮吹仪(美国Organomation公司)。

Cr(NO3)3·9H2O、2-氨基对苯二甲酸、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。NaCl、NaOH、HCl购买自国药集团化学试剂有限公司(上海)。HPLC级的甲醇和丙酮购买自T.Baker(Deventer,Netherlands)。试验用去离子水采用Milli-Q纯水系统(美国Millipore)纯化。

6种有机磷农药标准样品甲拌磷、甲基毒死蜱、毒死蜱、对硫磷、倍硫磷、喹硫磷(1 000 μg/mL，丙酮)购自农业部环境保护科研监测所(天津)，三苯基磷(0.25 g)购自上海安谱实验科技股份有限公司。采用丙酮稀释以上标准溶液，配制成5 μg/mL的有机磷混合标准储备液，在后续添加回收试验中，按照实验要求加入以上储备液得到所需的浓度。所有标准溶液储藏在-20 ℃冰箱中避光保存。

1.2 仪器条件

色谱条件：Rtx-50(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱(购自RESTEK公司)；进样口温度：250 ℃；升温程序：初始温度40 ℃，保持4 min，以25 ℃/min的速度升至125 ℃，再以10 ℃/min 的速度升至30 ℃保持5 min；载气：高纯度氦气(99.999%)；进样体积：1.0 μL；不分流模式进样，色谱柱流速为1.0 mL/min。

质谱条件：电子轰击电离源(EI)；电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；连接口传输线温度：250 ℃；碰撞气：高纯度氩气(99.999%)；溶剂延迟切断时间：3.5 min；数据采集模式：多重反应监测模式(MRM)。

1.3 材料合成

MIL-101(Cr)参照文献的方法合成[19]。

氨基化的MIL-101(Cr)合成参照文献方法[20]。Cr(NO3)3·9H2O(3.2 g，8 mmol)，2-氨基对苯二甲酸(1.45 g，8 mmol)和NaOH(0.8 g，20 mmol)加入60 mL去离子水中，室温搅拌5 min。将反应液转至200 mL聚四氟乙烯高压釜中，并150 ℃水热反应12 h。产物冷却至室温后，离心收集绿色沉淀物，用DMF洗涤数次，然后在100 ℃下用热酒精洗涤24 h，除去产品孔隙中未反应的2-氨基对苯二甲酸。最后产物在80 ℃真空干燥备用。

1.4 样品采集

所有稻米样品购买于武汉市场，用高速粉碎机研磨成粉，4 ℃密封保存，备用。

1.5 样品分析过程

称取5.0 g匀质后的稻米样品至50 mL离心管中，加入10.0 mL水浸润30 min。加入20 mL乙腈，超声提取30 min后，加入5.0 g NaCl，涡旋30 s后以4 200 r/min离心5 min，取上清液10 mL，氮气吹干，加入5 mL的5% NaCl溶液，涡旋溶解后，进行下一步的注射泵辅助的微固相萃取。

注射泵辅助的微固相萃取按以下步骤开展。取5 mg的MIL-101(Cr)-NH2放入孔径为0.45 μm的微孔滤膜中，将材料均匀地负载在滤膜表面，用3 mL的5% NaCl溶液对材料进行活化。随后，将上样液在注射泵的作用下以0.7 mL/min的流速通过萃取滤膜完成有机磷的萃取，最后用5 mL丙酮以0.7 mL/min的流速解吸材料上的有机磷农药，解吸液在40 ℃氮气吹干，加入20 μL的1 mg/L的三苯基磷内标溶液，丙酮定容至1 mL，GC-MS/MS进行分析检测。样品分析全部过程如图1所示。

图1 稻米样品分析过程示意图Fig.1 Schematic diagram of rice sample analysis process

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱条件的优化

选择了常用的6种有机磷农药进行方法学的研究考察。为了达到更好的分析灵敏度和选择性，对串联质谱的检测条件如碰撞能量、前体离子、产物离子等进行了优化，在全扫描模式下选择强度较高的离子作为母离子，通过优化不同的碰撞电压，得到强度较高的子离子，对每种农药选择两个离子对，分别为定量离子对和定性离子对。6种农药以及内标物的保留时间、碰撞电压以及定量定性的离子对参数如表1所示，优化条件下分析物的MRM色谱图如图2所示。

表1 6种有机磷农药和内标三苯基磷的保留时间和质谱定性、定量参数Table 1 The retention time and MS parameters of 6 OPPs and triphenyl phosphine for quantification and confirmation

图2 稻米中添加50 μg/kg的6种有机磷农药的多反应监测色谱图Fig.2 MRM chromatograms of blank rice sample spiked at 50 μg/kg of 6 OPPs under optimal conditions

2.2 注射泵辅助μ-SPE的优化

在空白稻米中添加50 μg/kg的有机磷农药，对注射泵辅助μ-SPE的条件进行优化。

2.2.1 吸附剂用量考察了MIL-101(Cr)-NH2纳米材料用量在1～20 mg范围内对各目标分析物萃取效率的影响。如图3所示，在1～5 mg范围内，6种有机磷农药萃取效率呈上升趋势，并在5 mg时萃取效率最大；5 mg以上时，萃取效率逐渐降低，这可能是由于吸附剂用量太大时，分析物无法解吸完全，导致吸附效率降低。因此，选择5 mg吸附剂用量。

图3 材料用量对有机磷类农药萃取效率的影响Fig.3 Effect of material consumption on extraction efficiency

2.2.2 解吸溶剂体积的优化采用丙酮作为解吸溶剂，考察了解吸体积1～7 mL对目标分析物的萃取效率的影响，其结果从图4可以看出，丙酮用量从1 mL增加到7 mL时，解吸效率均呈增加趋势，其中解吸体积从1 mL增加到5 mL，萃取效率增加较快，由5 mL增加到7 mL时，萃取效率变化不明显。因此，在考虑回收率和溶剂消耗量的前提下，最终选择5 mL的丙酮作为解吸液。

图4 解吸液用量对有机磷类农药萃取效率的影响Fig.4 Effect of desorbed liquid dosage on extraction efficiency

2.2.3 解吸速率的优化在注射泵推动样品溶液完成萃取的过程中，流速对有机磷农药的萃取有重要影响。利用恒流泵控制其解吸速率，分别将解吸速率控制在0.5～2.0 mL/min。如图5所示，流速在0.5～0.7 mL/min时，萃取效率略有降低；0.7～2.0 mL/min，萃取效率呈现快速下降的趋势。这是由于随着上样流速的增加，有机磷农药与氨基官能化MIL-101(Cr)不能充分地作用，导致回收率降低。为获得较高的回收率同时节约样品萃取的时间，将上样流速定为0.7 mL/min。

图5 上样流速对有机磷类农药萃取效率的影响Fig.5 Effect of loading rate on extraction efficiency

2.2.4 盐浓度的优化离子强度的改变能够影响待测物在溶液和萃取材料间的分配系数，一方面盐浓度增加会产生盐析效应，提高目标物在材料上的萃取效率；另一方面盐浓度增加也会增加溶液的粘度，导致目标物的传质减弱，降低目标物的萃取效率。考察了NaCl质量浓度在1%～30%时对萃取回收率的影响。如图6所示，在NaCl质量浓度为5%时有机磷类农药的萃取效率最高。因此，在样品溶液中添加质量浓度为5%的NaCl。

图6 离子强度对有机磷类农药萃取效率的影响Fig.6 Effect of ionic strength on extraction efficiency

2.2.5 待测水样酸碱度的优化环境水的pH会影响分析物的存在状态和吸附剂的表面电荷，从而影响目标物的萃取效率。由于有机磷在碱性环境中易分解，因此在保证待测物稳定的前提下，研究了pH=3～8对萃取效率的影响，其结果如图7。在待测水样pH=3～7的范围内基本呈现上升趋势，并在pH=7处提取效率取得最大值。这可能是由于随着pH的升高，氨基官能化的MIL-101(Cr)表面官能团质子化程度逐渐减弱，氨基逐渐释放出来，其与OPPs农药的氢键作用增强，萃取效率逐渐提高。因此，选择pH=7考察下一步的实验。

图7 pH值有机磷类农药萃取效率的影响Fig.7 Effect of pH on extraction efficiency

2.2.6 萃取效率的比较实验比较了氨基官能化的MIL-101(Cr)和MIL-101(Cr)对有机磷类农药的萃取效果。结果发现，氨基官能化的MIL-101(Cr)对有机磷类农药萃取效率更高，这可能是由于氨基的存在可以与有机磷类农药产生更强的氢键相互作用，提高了农药的萃取效率。

2.3 方法学考察

为了考察方法的线性，在空白稻米中添加5～200 μg/kg的有机磷农药，按照以上优化程序对样品进行处理和分析，根据分析物和内标物的峰面积比和浓度比得到线性方程。检出限和定量限分别按照3倍和10倍的信噪比得到。如表2所示，6种有机磷类农药在5～200 μg/kg范围具有良好的线性关系，相关系数的平方大于0.9964。方法的检出限和定量限分别在0.6～1.8 μg/kg和2.5～5.0 μg/kg。依据GB 2763-2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》稻米中甲拌磷、甲基毒死蜱、毒死蜱、对硫磷、倍硫磷和喹硫磷的最大残留限量分别为0.05、5.0、0.5、0.1、0.1和0.2 mg/kg，该方法的灵敏度高，可以满足稻米中该类农药分析的要求。

表2 稻米样品中6种有机磷农药的线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear ranges,correlation coefficients (R2),LODs and LOQs of 6 OPPs rice samples analyzed by MIL-101(Cr)-NH2 based μ-SPE/GC-FPD

进一步对方法的准确度和精密度进行了考察。准确度采用回收率进行评价，回收率是通过计算实测值(采用标准曲线计算)和实际添加值的比值得到。如表3所示，在空白稻米中添加10、50和100 μg/kg浓度水平的方法相对回收率在83.0%～113.3%之间，日内日间相对标准偏差小于12.5%，以上结果表明我们所建立的μ-SPE/GC-MS/MS方法分析稻米中的有机磷类农药具有良好的准确度和精密度，可以用于实际稻米样品的分析检测。

表3 稻米样品中6种有机磷农药的回收率和日内日间相对标准偏差Table 3 Recovery and inter-day and intra-day RSDs of six OPPs in rice samples analyzed by MIL-101(Cr)-NH2 based μ-SPE-GC-MS/MS

(续表3)

2.4 实际样品的分析

将所建立的方法用于10个稻米样品中6种有机磷农药残留的分析，结果表明，在样品中未检出有机磷农药。

3 结论

本文将氨基官能化MIL-101(Cr)作为注射泵辅助的μ-SPE的吸附剂，结合GC-MS/MS的分离检测，建立了稻米样品中6种有机磷农药的快速灵敏的分离分析新方法。对影响有机磷农药萃取效率的材料用量、解吸溶剂的体积、解吸速率、有机磷农药的含盐量与pH等因素进行了优化。在优化好的条件下，对方法学性能进行了考察，并将其用于实际样品的分析，取得了很好的效果。该方法前处理简单，相较于传统分散μ-SPE，无需离心分离的步骤，样品的富集净化有效避免了基质效应对方法性能的影响，为食品中有机磷类农药残留的检测提供了一种有效的分离分析新方法。